Epigenetic regulation of non-coding RNAs in cancer

Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Biologia Celular e Molecular, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraTumoral evolutionary process occurs through the sequential accumulation of mutations and epimutations that are responsible for cell heterogeneity and sub-clonal selection, as well as for drug resistance and patients associated mortality. Recently, diverse classes of non-coding RNAs (ncRNAs) were described to be implicated in the regulation of key players of carcinogenesis. By standard and high-throughput methods, we analyzed the epigenetic landscape of different types of cancer, uncovering cancer-related pathways, emphasizing those related to the regulation of ncRNAs. Small nucleolar RNAs (snoRNAs) guide post-transcriptional modifications of spliceosomal and ribosomal RNAs. Some members of this class of RNAs are disrupted in cancer, where modifications in ribosome biogenesis have also been implicated. We verified that SNORD123, ACA59B and U70C are transcriptionally silenced by DNA hypermethylation of the CpG Island that overlaps the promoter region of their host gene. Of particular interest, SNORD123 and ACA59B are conserved across vertebrates but they do not have a known target (orphan snoRNAs). Taking into account that these snoRNAs are expressed at least in normal colon and are epigenetically repressed in some colorectal cancer cell lines, we suggested that they can have a potential contribution to carcinogenesis. Moreover, we described the DNA hypermethylation of these three snoRNAs in leukemia samples. Piwi-interacting RNAs (piRNAs) are mainly expressed in germline cells, playing a key role in the epigenetic silence of transposons or guiding their cleavage. We reported the epigenetic transcriptional inactivation of the genes encoding the piRNA-related proteins, PIWIL1, PIWIL2, PIWIL4 and TDRD1, in both seminomas and non-seminomas. These epigenetic lesions occur in a context of piRNA downregulation and loss of DNA methylation at LINE-1 loci. Importantly, recent studies had shown a similar epigenetic transcriptional disruption in other cancer types; and in non-genetic infertility syndromes, that are epidemiologically linked with testicular cancer. To better characterize the epigenetic landscape of a cancer cell, we interrogated the entire methylome in several cancer and normal samples. We first established the methylome of two acute myeloid leukemia (AML) cell lines, OCI-AML5 and OCI-AML3, the last one harboring a missense mutation in DNMT3A, present in ~20% of the AML patients. By comparison with the methylation profile of AML samples, we suggested a set of twelve candidate target loci for DNMT3A in AML, validating their transcriptional reactivation in our cell line model. Thus, the leukemogenic gene MEIS1 was actively expressed in OCI-AML3. By screening the highest-ranked differentially methylated regions that potentially regulate non-protein coding genes we described a signature of four hypomethylation-associated transcriptional reactivated ncRNAs in the DNMT3A mutant cell line, namely ENST00000413346, LOC100506585, ENST00000443490 and MIRLET7B host gene (MIRLET7BHG). We also suggested that some of the DNMT3A identified potential targets could be linked to worst prognosis observed in AML patients harboring the DNMT3A mutation, particularly MEIS1 and the host gene that carries both let-7a-3 and let-7b. These two microRNAs were previously described to be overexpressed in AML. Based on the loss of differentiation in cancer cells and expanding our study to other tissues, we interrogated the methylation profile of genomic regions known to be responsible for cell identity, namely super-enhancers. We established a correlation among tumor-related hypermethylation of super-enhancers and transcriptional silencing of the corresponding related genes. Our results showed that their methylation profile is also associated with specific cancer types. However, the methylation of the super-enhancer that regulates the host gene of let-7a-3 and let-7b tumor suppressors was linked to their silencing in both lung and breast epithelial cancers. In colorectal cancer, we described tumor-related super-enhancers undergoing hypomethylation-related transcriptional activation of the related genes, such as MYC and RNF43 oncogenes. We hypothesized that the impaired expression and binding of transcription factors could establish novel super-enhancers. We identified FOXQ1 as a probable transcription factor responsible for the loss of DNA methylation at colorectal cancer-specific super-enhancers that control MYC and RNF43. DNA methylomes highlight the epigenetic landscape that regulates the expression of key players in cancer biology. Some of these players are non-coding RNAs that should be exploited as biomarkers for cancer diagnosis, or as targets in personalized therapeutic approaches to control tumor progression and/or metastasis.O processo evolutivo de um tumor é feito através da acumulação sequencial de mutações e epimutações, sendo estas responsáveis pela heterogeneidade celular e por uma seleção sub-clonal, bem como pela resistência dos doentes a fármacos e mortalidade associada. Recentemente, diversas classes de RNAs não-codificantes (ncRNAs) foram implicadas na regulação de elementos-chave da carcinogénese. Através de métodos standard e de high-throughput, analisámos o perfil epigenético de diferentes tipos de cancro, encontrando vias transcripcionais alteradas, dando especial ênfase às vias relacionadas com a regulação dos ncRNAs. Os small nucleolar RNAs (snoRNAs) dirigem modificações pós-transcripcionais de RNAs spliceossomais e ribossomais. Alguns membros desta classe de RNAs estão desregulados em cancro, onde modificações na biogénese do ribossoma também têm sido implicadas. Verificámos que os snoRNAs SNORD123, ACA59B e U70C estão silenciados transcripcionalmente por um aumento da metilação do DNA da ilha CpG sobreposta à região promotora do seu gene hospedeiro. É de destacar que os SNORD123 e ACA59B estão conservadas em vertebrados, mas não têm um alvo conhecido (snoRNAs órfãos). Tendo em conta que estes são expressos em cólon saudável e que estão epigeneticamente silenciados em algumas linhas celulares de cancro colorrectal, sugerimos que também podem contribuir para o processo de carcinogénese. Além disso, o facto de termos detectado um aumento de metilação do DNA correspondente a estes três snoRNAs em amostras de leucemia, reforça a nossa teoria. Os piwi-interacting RNAs (piRNAs) são expressos principalmente em células germinativas, desempenhando um papel fundamental no silenciamento epigenético de transposons ou dirigindo a sua clivagem. Os nossos resultados demonstram o silenciamento epigenético da transcripção dos genes que codificam para as proteínas relacionadas com os piRNAs, nomeadamente PIWIL1, PIWIL2, PIWIL4 e TDRD1, tanto em seminomas como em não-seminomas. Estas lesões epigenéticas ocorrem num contexto de baixos níveis de piRNAs e de perda de metilação do DNA nas regiões correspondentes ao LINE-1. De forma semelhante, estudos recentes descrevem o silenciamento epigenético da transcrição noutros tipos de cancro; e em síndromes não genéticos de infertilidade, neste caso epidemiologicamente associados ao cancro de testículo. De maneira a caracterizar melhor o perfil epigenético de uma célula cancerígena, estudámos o metiloma de vários tipos de cancro e de amostras de tecido normal. Em primeiro lugar, estabelecemos o metiloma de duas linhas celulares de leucemia mieloide aguda (AML), OCI-AML5 e OCI-AML3, a última das quais tem uma mutação missense no gene DNMT3A, estando presente em ~ 20% dos doentes com AML. Por comparação com o perfil de metilação do DNA de amostras de AML, sugerimos um conjunto de doze regiões alvo para a DNMT3A na AML, validando a reativação da sua transcrição no modelo de linhas celulares. Deste modo, vimos que o gene leucemogénico MEIS1 se expressa ativamente em OCI-AML3. Analisando as regiões com maiores diferenças a nível de metilação de DNA e que pudessem potencialmente regular genes não codificantes para proteínas, detetámos a existência de quatro ncRNAs, ENST00000413346, LOC100506585, ENST00000443490 e MIRLET7BHG, associados a uma reativação transcripcional devido à perda de metilação do DNA na linha celular portadora da mutação no gene DNMT3A. Sugerimos que alguns dos potenciais alvos da DNMT3A, poderiam estar relacionados com pior prognóstico em pacientes com AML que são portadores da mutação no gene DNMT3A, especialmente MEIS1 e o gene hospedeiro que alberga let-7a-3 e let-7b, tendo já sido descrito que estes microRNAs exibem maior expressão em AML. Tendo presente a perda de diferenciação das células cancerígenas e querendo expandir o nosso estudo a outros tecidos, investigámos o perfil de metilação de regiões descritas como responsáveis pela identidade celular, os super-enhancers. No contexto tumoral encontrámos uma correlação entre o aumento de metilação do DNA dos super-enhancers e o silenciamento transcripcional dos genes correspondentes. Apesar do perfil de metilação dos super-enhancers ser específico do tipo de cancro, a metilação do super-enhancer que regula o gene hospedeiro dos supressores tumorais let-7a-3 e let-7b foi associada ao seu silenciamento, tanto em cancro de pulmão como em cancro de mama, ambos epiteliais. No caso do cancro colorrectal, descrevemos super-enhancers submetidos a uma perda de metilação associada à ativação transcripcional dos oncogenes MYC e RNF43. Estabelecemos ainda a teoria de que a expressão e ligação desreguladas de fatores de transcripção poderiam promover a formação de novos super-enhancers. Identificámos FOXQ1 como um provável fator de transcripção, responsável pela perda de metilação dos super-enhancers específicos de cancro colorrectal e que controlam MYC e RNF43. Os metilomas de DNA destacam o perfil epigenético que regula a expressão de elementos-chave na biologia do cancro. Alguns destes elementos são ncRNAs que deveriam ser explorados como biomarcadores para diagnóstico de cancro e também como alvos em estratégias de terapia personalizada, com vista ao controlo da progressão tumoral e/ou das metástases