Molecular characterization of Giardia lamblia from patients of a referral hospital of Rio de Janeiro/Brazil: application of multilocus genotyping to study the inter and intra-assemblage variations

Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Microbiologia e Parasitologia, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraGiardia lamblia é um dos protozoários intestinais mais frequentemente detectados no homem. Apesar da alta prevalência, a epidemiologia da giardíase e de outros parasitas intestinais tem sido pouco documentada no Brasil, principalmente no Estado do Rio de Janeiro. G. lamblia é considerado um complexo de espécies, cujos membros apresentam pouca variação na sua morfologia, mas com uma extensa variabilidade genética. A caracterização genética de G. lamblia tem sido pouco relatada no Rio de Janeiro (Brasil) e estudos de epidemiologia molecular foram realizados somente nos últimos anos. Portanto, o trabalho teve como objectivos (i) determinar a prevalência de parasitas intestinais no Rio de Janeiro e fornecer uma análise detalhada da sua distribuição geográfica, considerando-se os factores demográficos, socioecónomicos e epidemiológicos; (ii) determinar a prevalência dos diferentes genótipos de G. lamblia e detectar infecções mistas; (iii) identificar as variações genéticas inter e intra-genotípicas em G. lamblia; (iv) correlacionar os genótipos com os sintomas em pacientes com e sem VIH/SIDA. O levantamento transversal foi realizado em pacientes atendidos no Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas (FIOCRUZ). O diagnóstico de parasitoses intestinais foi realizado em amostras de fezes através dos métodos de sedimentação, flutuação em solução de sulfato de zinco, Kato-Katz, Baermann-Moraes e Graham e pela coloração da hematoxilina férrica e safranina. O local de residência dos indivíduos, infectados e não infectados, foi georreferenciado permitindo avaliar a influência das condições socioeconómicas, através do índice de privação material (MDI), na incidência de parasitas. As amostras de fezes positivas para G. lamblia foram caracterizadas geneticamente por PCR-RFLP, qPCR e sequenciamento tendo como alvo os genes β-giardina (bg), glutamato desidrogenase (gdh), triose fosfato isomerase (tpi), quadro de leitura aberto C4 (orfC4) e subunidade menor do ARN ribossómico (ssu rRNA). Dos 3245 pacientes analisados, 569 (17,5%) estavam infectados com pelo menos um parasita. As espécies mais frequentes foram Endolimax nana (28,8%), Entamoeba coli (14,8%), Complexo Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar (13,5%), Blastocystis hominis (12,7%) e Giardia lamblia (8,1%). A distribuição geoespacial das parasitoses intestinais não foi aleatória ou homogénea, sendo influenciada pelo MDI. Das 65 amostras positivas para G. lamblia, 41 (63,1%) foram amplificadas com êxito pelo nested-PCR dos genes bg e gdh e subsequentemente caracterizadas por PCR-RFLP: 16 foram tipificadas no sub-genótipo AII, 7 no BIII, 4 no BIV e 8 uma mistura de BIII e BIV. Após a análise pela técnica de qPCR, um total de 55 (84,6%) amostras foram amplificadas usando pelo menos um locus. Resultados da genotipagem por múltiplos genes (MLG) mostraram que 29 (52,7%) amostras pertenciam ao genótipo A e 26 (47,3%) ao genótipo B. A variação intra-genotípica foi determinada através do sequenciamento de múltiplos genes (MLST). Quatorze amostras do genótipo A foram genotipadas nos três loci (bg/tpi/gdh). Dois MLG previamente descritos foram identificados (AII-1 e AII-4) e dois novos MLG foram propostos (AII-8, perfil A2/A2/A4 e AII-9, perfil A3/A2/A2). A análise das sequências mostrou que os isolados do genótipo B apresentaram um polimorfismo genético maior do que os isolados do genótipo A. Novas sequências do genótipo B foram encontradas e a maioria (66,7%) tiveram nucleótidos heterogéneos, impedindo a definição dos MLGs. Das 65 amostras positivas para G. lamblia, 38 eram de pacientes VIH positivos e 27 de pacientes VIH negativos. Nos pacientes infectados pelo VIH, 19 (55,9%) isolados de G. lamblia foram genotipados como genótipo B e 9 (47,4%) pacientes apresentaram uma contagem T CD4 menor do que 200 células/mm3. Além disso, observou-se um maior número de amostras pertencentes ao genótipo B nos casos sintomáticos (11 de 19; 57,9%). Este trabalho é o primeiro a fornecer dados epidemiológicos sobre a prevalência e distribuição das parasitoses intestinais no Rio de Janeiro. O MDI mostrou que os parasitas intestinais estão fortemente associados com o nível socioeconómico da população, identificando-se áreas de vulnerabilidade social. Pela primeira vez foi detectado o genótipo B no Rio de Janeiro e o MLG foi utilizado na caracterização genética de G. lamblia. O uso de vários marcadores moleculares e do qPCR permitiu-nos determinar com confiança a distribuição dos genótipos na população e confirmou que as infecções mistas pelos genótipos A e B não estavam presentes. O MLST possibilitou a identificação de dois novos subtipos em ambos genótipos e a descrição de novos MLGs no genótipo A. Globalmente, o nosso trabalho contribuiu para um melhor conhecimento sobre a diversidade genética do parasita e melhorou a nossa compreensão sobre a epidemiologia da doença através da elucidação da dinâmica da giardíase na população do Rio de Janeiro. Os nossos resultados sugerem que o genótipo B é mais detectado em pacientes VIH positivos e que, provavelmente, o baixo número de células T CD4 favorece a replicação do genótipo B. De acordo com o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo sobre os genótipos de G. lamblia e os sintomas em pacientes com e sem vírus VIH/SIDA e a sua associação com a contagem de células CD4 T. Como a infecção pelo VIH é um factor de risco para parasitoses intestinais, incluindo G. lamblia, a detecção e tratamento destas infecções são medidas importantes para melhorar a qualidade de vida dos pacientes VIH positivos.Giardia lamblia is one of the most frequent human intestinal protozoa reported worldwide. Despite the high prevalence, the epidemiology of giardiasis and other intestinal parasites has been poorly documented in Brazil, principally in Rio de Janeiro State. G. lamblia is considered a species complex, whose members show little variation in their morphology, but have a remarkable genetic variability. The genetic characterization of G. lamblia has been scarcely reported in Rio de Janeiro (Brazil) and molecular epidemiology researches have been conducted only in the last few years. Therefore, the work aimed to (i) estimate the prevalence of intestinal parasites in Rio de Janeiro and provide a detailed analysis of their geographical distribution, considering demographic, socio-economic, and epidemiological factors; (ii) determine the prevalence of G. lamblia assemblages and detect mixed infections; (iii) identify inter- and intra-assemblage genetic variation in G. lamblia; and (iv) correlate assemblages with symptoms in patients with and without HIV/AIDS. The cross-sectional survey was conducted among patients attending the Evandro Chagas National Institute of Infectious Diseases (FIOCRUZ). For the diagnosis of intestinal parasites, stool samples were collected and processed by sedimentation, flotation in zinc sulphate solution, Kato-Katz, Baermann-Moraes, Graham methods, and iron haematoxylin and safranin stainings. The place of residence of infected and uninfected individuals was georeferenced, which allowed the assessment of the influence of socioeconomic conditions, through the material deprivation index (MDI), on the incidence of parasites. The positive stool samples for G. lamblia were genetic characterized by PCR-RFLP, qPCR and sequencing targeting β-giardin (bg), glutamate dehydrogenase (gdh), triose phosphate isomerase (tpi), open reading frame C4 (orfC4) and small-subunit ribosomal RNA (ssu rRNA) genes. Of the 3245 patients analysed, 569 (17.5%) were infected with at least one parasite. The most frequent species were Endolimax nana (28.8%), Entamoeba coli (14.8%), Complex Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar (13.5%), Blastocystis hominis (12.7%), and Giardia lamblia (8.1%). Geospatial distribution of intestinal parasitic infections was not random or homogeneous, but was influenced by the MDI. Out of the 65 G. lamblia positive samples, 41 (63.1%) were successfully amplified by nested-PCR of bg and gdh genes, and subsequently characterized by PCR-RFLP. Among them, 16 were typed as sub-assemblage AII, 7 as BIII, 4 as BIV and 8 as a mixture of BIII and BIV. After the analysis by qPCR assay, a total of 55 (84.6%) samples were amplified using at least one locus. Multilocus genotyping (MLG) results showed that 29 (52.7%) samples belonged to assemblage A and 26 (47.3%) to assemblage B. The intra-assemblage genetic variation was determined via multilocus sequence typing (MLST). Fourteen assemblage A samples were genotyped at the three MLST loci (bg/tpi/gdh). Two previously identified MLG were found (AII-1 and AII-4), and two novel MLG are proposed (AII-8, profile A2/A2/A4; and AII-9, profile A3/A2/A2). Sequence analysis showed that assemblage B isolates have a higher nucleotide variation, than assemblage A isolates. Novel assemblage B sequences were described and most (66.7%) had heterogeneous nucleotides, which prevented the definition of MLGs. Thirty-eight of 65 positive samples for G. lamblia were from HIV positive patients and 27 were from HIV negative patients. Of the HIV infected patients, 19 (55.9%) isolates were genotyped as assemblage B of which 9 (47.4%) patients had a CD4 T cell count below 200 cells/mm3. In addition, we found a greater number of samples belonging to assemblage B in symptomatic cases (11 of 19; 57.9%). This work provides the first epidemiological information on the prevalence and distribution of intestinal parasitic infections in Rio de Janeiro, pointing out that the prevalence of these parasites remain high. MDI showed that intestinal parasites were strongly associated with the socioeconomic status of the population, thus making it possible to identify social vulnerable areas. This is the first time that assemblage B was detected and that MLG tools has been used to genetically characterise G. lamblia isolates in human clinical samples from Rio de Janeiro. The use of several molecular markers and the qPCR allowed us to reliably determine the distribution of assemblages in the population and confirmed that mixed infections of assemblages A and B were not present. MLST enabled the identification of novel subtypes in both assemblages and the description of two novel assemblage A MLGs. Our work has provided a new insight into the genetic diversity of parasite and improved our understanding of the epidemiology of the disease by elucidating the dynamics of giardiasis in the population of Rio de Janeiro. Our data suggest that assemblage B is very likely to be found in HIV positive patients and probably the lower CD4 T cell count gives advantages for assemblage B replication. To the best of our knowledge, this is the first study that provides information on G. lamblia assemblages and symptoms in patients with and without HIV/AIDS virus and their association with CD4 T cell counts. As HIV infection increases the risk of having intestinal parasitic infections, including G. lamblia, the detection and treatment of infections are important measures to improve the quality of life of HIV positive patients.COMPETE - PEstC/SAU/LA000172013-2014National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) - 245531/2012-