Efeito de nanopartículas com base em biopolímeros no aumento da permeabilidade de insulina através do epitélio intestinal

Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Tecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraA via oral é considerada a via de administração mais adequada e fisiológica. Uma insulina oral capaz de induzir um efeito antihiperglicémico eficiente, quer para substituir ou complementar a terapia da diabetes, é o principal objetivo dos profissionais de saúde, governos e doentes diabéticos. A terapia oral está associada não apenas com o desejo de excluir agulhas da rotina diária do doente diabético, como também com a disposição fisiológica de insulina que iriam obter, resultando numa melhor homeostase da glucose. No entanto, a terapia oral é limitada por várias barreiras fisiológicas e apesar dos inúmeros esforços ao longo das últimas décadas para desenvolver sistemas de administração de insulina, ainda não existe nenhuma insulina oral comercialmente disponível. O desejo de administrar insulina por via oral de uma forma conveniente e eficaz levou à intensa investigação de novos sistemas de libertação. Conhecer o efeito das nanopartículas ao nível da eficácia terapêutica da insulina após a administração oral é essencial para a concepção de um sistema de libertação adequado. Esta tese surgiu neste contexto, tendo como objectivo desenvolver um sistema de nanolibertação com características físicas adequadas para a administração oral de insulina, ao avaliar o seu comportamento em todo o trato gastrointestinal e, ao nível celular. Em primeiro lugar, nanopartículas de alginato e sulfato de dextrano contendo insulina produzidas pelo método de emulsificação/gelificação interna foram desenvolvidas de forma a obter um nanosistema com base em biopolímeros com as propriedades físicas requeridas para a administração oral. O efeito do tamanho das gotículas da emulsão nas partículas finais foi avaliado cuidadosamente, enquanto a atividade da insulina foi monitorizada após cada passo do processo. Houve uma diminuição do tamanho das gotículas da emulsão quando a ultrasonicação foi utilizada durante a fase de emulsificação, efeito que foi ainda mais pronunciado quando um agente co−tensioactivo foi adicionado. As interações entre os biopolímeros e a insulina foram preditos através de estudos de modelagem molecular por meio de cálculos de mecânica quântica, o que permitiu a previsão do modelo de interação. Os estudos de libertação in vitro indicaram que a integridade das nanopartículas foi bem preservada em fluido gástrico artificial, e a estabilidade conformacional da insulina foi assegurada pelas técnicas de espectroscopia de dicroísmo circular e de infravermelho com transformada de Fourier (Capítulo 2). Os biopolímeros têm um efeito importante sobre as propriedades das nanopartículas e podem ter influência sobre o seu comportamento biológico. Biopolímeros policatiónicos, tais como o quitosano, podem ser usados para reticular com nanopartículas com base em alginato polianiónico de forma a proporcionar−lhes a capacidade de melhorar a bioadesão e permeabilidade ao nível celular. Neste sentido, foi explorado um estudo racional envolvendo o revestimento das nanopartículas com quitosano de forma a melhorar os seus parâmetros físico−químicos (Capítulo 3). Devido à elevada área de superfície das nanopartículas, os fatores que influenciam sua absorção gastrointestinal, mais precisamente o seu tamanho e fenómenos de agregação, foram estudados através de fluidos gastrointestinais artificiais. Os efeitos individuais do revestimento com quitosano, assim como do revestimento adicional de albumina, foram cuidadosamente avaliados. Foi realizada a aplicação da albumina como um revestimento mais externo para as nanopartículas revestidas com quitosano, uma vez que a albumina revelou atuar como um alvo sacrificial de forma a evitar a degradação de insulina, impedindo as proteases de alcançar a insulina que se encontra dentro das nanopartículas, e estabilizando as nanopartículas tanto no ambiente ácido como no ambiente intestinal. De seguida, o efeito das nanopartículas no aumento da permeação in vitro da insulina através da membrana intestinal foi também avaliado, utilizando modelos in vitro de co−culturas de células Caco−2, Caco−2/HT29−MTX, e Caco−2/HT29−MTX/Raji B (Capítulo 4). O duplo revestimento com quitosano e albumina foi concretizado com sucesso, usufruindo das suas propriedades de protecção, mucoadesão e melhor absorção. A aplicação da albumina proporcionou maior estabilidade ao nível do tamanho das nanopartículas em condições gastrointestinais, com menor agregação e mais uniformidade na distribuição de tamanhos, impedindo a libertação da maioria da insulina em pH gástrico e sustendo a libertação em pH intestinal, permitindo que a insulina possa ser libertada nos locais de absorção. Nas experiências celulares, as nanopartículas aumentaram significativamente a permeabilidade da insulina através dos modelos in vitro, um padrão que se apresentou em conformidade com o perfil de libertação de insulina. De seguida, a capacidade deste nanosistema oral em melhorar a disponibilidade farmacológica da insulina em ambos os modelos animais de diabetes tipo 1 e tipo 2 foi pela primeira vez analisada (Capítulo 5). Houve um efeito antihiperglicémico significativo após a administração oral a ambos os modelos, embora o efeito antihiperglicémico tenha sido mais prolongado no modelo de diabetes tipo 1. A biodistribuição das nanopartículas foi também avaliada, revelando uma maior interação das nanopartículas com as paredes do intestino delgado, o que pode ser justificado pelas propriedades mucoadesivas do quitosano. Finalmente, nesta tese, a eficácia das nanopartículas ao nível da permeabilidade da insulina através das células epiteliais do intestino foi integralmente avaliada. Foi realizada uma avaliação sistemática dos mecanismos celulares e moleculares utilizados pelas nanopartículas para o transporte de insulina através do intestino (Capítulo 6). Até agora, se a absorção da insulina ocorria através de um ou mais mecanismos de transporte era ainda um facto desconhecido, uma vez que os estudos que elucidavam os mecanismos de absorção da insulina não usavam modelos celulares intestinais que representam simultaneamente os enterócitos, as células de goblet e as células M. A permeabilidade das nanopartículas contendo insulina diminuiu após redução da temperatura e após co−incubação com clorpromazina, sugerindo um transporte ativo da insulina por endocitose mediada por clatrina. Além disso, a inibição da permeabilidade com o pré−tratamento com clorato de sódio sugeriu que a interação entre o glicocálice e as nanopartículas foi crítica para a permeação de insulina.The oral route is the most suitable and physiological delivery route. Oral insulin able to induce an efficient antihyperglycemic effect either to replace or complement diabetes therapy is the major goal of health providers, governments and diabetic patients. Oral therapy is associated not only with the desire to exclude needles from the daily routine of diabetic patient but also with the physiological provision of insulin they would get, resulting in a better glucose homeostasis. However, it is limited by various physiological barriers and despite the numerous efforts over the past few decades to develop insulin delivery systems, there is still no commercially available oral insulin. The desire to deliver insulin by the oral route in a conveniently and effectively way has led to the intense investigation of new delivery systems. The understanding of the effect of nanoparticles (NP) on enhancing insulin therapeutic effect after oral delivery is crucial for the design of an adequate delivery system. This thesis emerged in this context and aims to develop a nanodelivery system with suitable physical characteristics for oral insulin administration, by evaluating its behavior across the gastrointestinal (GI) tract and at the cellular level. First, insulin−loaded alginate/dextran sulfate−based NP (ADS−NP) produced by the emulsification/internal gelation technique were developed in order to achieve a biopolymer−based nanosystem with the required physical properties for oral delivery. The effect of the emul¬sion droplet size on the resultant particles was carefully evaluated, while probing the activity of insulin after each step of the process. There was a decrease in the emulsion droplet size when ultrasonication was used during emulsification, which was more pronounced when a cosurfactant was added. The interactions between the biopolymers and insulin were predicted using molecular modeling studies through quantum mechanics calculations that allowed for the prediction of the interaction model. The in vitro release studies indicated well−preserved integrity of the NP in simulated gastric fluid (SGF) and the conformational stability of insulin was ensured by circular dichroism (CD) spectroscopy and Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy technique (Chapter 2). Biopolymers have an important effect on the NP’ properties and may have influence on their biological behavior. Polycationic biopolymers such as chitosan (CS) can be used to crosslink with polyanionic alginate−based NP to provide them the ability to improve bioadhesion and permeability at the cellular level. In this sense, a rational study involving the CS coating of the NP to enhance their physicochemical parameters was explored (Chapter 3). Giving the high surface area−to−volume ratio of NP, the factors influencing their GI uptake, more precisely their size and aggregation phenomena, were studied across simulated GI fluids. The individual effects of the CS coating, as well as the further coating of albumin (ALB), were carefully evaluated. The application of ALB as an outermost coat to the CS−coated NP was carried out, since ALB has revealed to act as a sacrificial target to avoid insulin degradation by preventing proteases from accessing insulin within the NP, and by stabilizing the NP either in the acidic or intestinal environment. Then, the effect of the NP on enhancing the insulin in vitro permeation through the intestinal membrane was also evaluated, using in vitro models of Caco−2, Caco−2/HT29−MTX and Caco−2/HT29−MTX/Raji B co−cultures (Chapter 4). The double coating with CS and ALB was successfully achieved, taking advantage of their protective, mucoadhesive and absorption−enhancing properties. The ALB application showed to provided better NP’ size stability in GI conditions with less aggregation and more uniformity of size distribution, preventing the release of the majority of insulin in the gastric pH and sustaining the release in the intestinal pH to allow insulin to be released in the sites of absorption. In the cellular experiments, the NP were found to significantly increase the permeability of insulin across the in vitro models, a pattern that was in accordance with the insulin release profile. Then, the ability of this nanosystem to improve the oral pharmacological availability (PA) of insulin in both the type 1 DM (T1D) and type 2 DM (T2D) animal models was for the first time carried out (Chapter 5). There was a significant antihyperglycemic effect after oral administration for both models, although the antihyperglycemic effect lasted longer in the model of T1DM. The biodistribution of the NP was also evaluated, revealing an augmented interaction of the NP with the small intestinal walls, which could be explained by the mucoadhesive properties of CS. Finally, in this thesis, the effectiveness of the insulin−loaded NP on the insulin permeability across intestinal epithelial cells was thoroughly assessed. A systematic evaluation of the cellular and molecular mechanisms used by the NP to transport insulin across the intestine was performed (Chapter 6). So far, whether the insulin uptake occurred through one or more pathway was still unknown, since the studies elucidating the absorption mechanisms of insulin did not make use of cell−based intestinal models that reproduce the enterocytes, and goblet and M cells simultaneously. The permeability of the insulin−loaded NP was reduced after the temperature was decreased and after co−incubation with chlorpromazine, suggesting an active insulin transport by clathrin−mediated endocytosis (CME). Moreover, the permeability inhibition with the pre−treatment with sodium chlorate suggested that the interaction between the glycocalix and the NP was critical for the insulin permeation