Characterization of novel β1 integrin interactors involved in the regulation β1 integrin trafficking

Dissertação de mestrado em Investigação Biomédica, realizado no Departamento de Medicina Molecular do Instituo Max Planck de Bioquimica em Munique, apresentado á Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraIntegrin signaling is involved in many aspects of cell function including adhesion, migration through tissues and signaling. Integrin signaling occurs when integrins are extended and ligand bound, and is mediated through interaction of signaling and adaptor proteins to the integrin cytoplasmic tails. The quality of integrin signaling is also influenced by their trafficking through the endosomal system and by their stability. Integrin cytoplasmic domain binding proteins are key to integrin function as integrins do not possess enzymatic activity. In the previous years the Fässler lab has set up different proteomic approaches to identify proteins that bind to the cytoplasmic domains of α5β1 integrin including pulldown experiments using the intracellular domains of α5β1 integrin, proximity-based biotinylation in living cells or adhesome isolation. Among the candidate interactors are proteins that localize to intracellular organelles involved in intracellular trafficking of transmembrane proteins such as the Golgi apparatus and different endosomal proteins. There is increasing evidence that integrin trafficking through the endosomal pathway and retrograde route profoundly affects their function, their ‘polarized’ distribution on the cell surface, the signaling properties of integrin-associated growth factor receptors and the turnover of ECM proteins such as fibronectin (FN). The aim of this master thesis is to confirm the interaction of these candidate cytosolic α5β1 integrin interactors, determine their subcellular localization in the cell and analyze integrin-mediated processes such as cell adhesion, spreading and migration in a loss-of-function situation for these proteins. We started by confirming the existence of a trimeric complex between Fam91a1, WDR11 and C17orf75 at the Golgi which stability is Fam91a1-dependent. This trimeric complex is involved in retrograde trafficking as its depletion impairs transport of CI-M6Pr and TGN46 to the trans-Golgi network (TGN), reduces CI-M6Pr levels like retromer-depleted cells and compromises TGN integrity. Importantly, the Fam91a1/WDR11/C17orf75 complex is essential for intracellular trafficking of α5β1 integrin and for effective cell migration. We confirmed the involvement of GARP and EARP complexes in retrograde transport. Finally, proteomic screenings revealed a potential association between Fam91a1/WDR11/C17orf75 complex and autophagy, endocytic signaling and pubertal development. Overall the results obtained in this project show that an α5β1 integrin interacting complex composed of Fam91a1/WDR11/C17orf75 plays a role on TGN-mediated retrograde trafficking of α5β1 integrin, cell migration and possibly mediate other major cellular processes like autophagy.O processo de sinalização via integrinas está envolvido em muitos aspetos da função celular incluindo adesão, migração através de tecidos e a referida sinalização. Esta sinalização via integrinas ocorre quando possuem uma conformação estendida e estão vinculadas/ligadas a um ligando e essa mesma sinalização é mediada por interações entre as caudas citoplasmáticas das integrinas e proteínas sinalizadoras ou adaptadoras. A eficiência da sinalização por integrinas depende também do seu tráfico através do sistema endossomal e pela sua estabilidade. As proteínas que se ligam ao domínio citoplasmático das integrinas são essenciais para a função das integrinas, pois as integrinas não possuem qualquer tipo de actividade enzimática. Nos últimos anos passados no laboratório do Dr. Fässler, foram estabelecidas diferentes abordagens de proteómica de forma a identificar poder identificar proteínas que se liguem aos domínios citoplasmáticos da integrina α5β1, estes incluem técnicas de pull-down com base nos domínios intracelulares da integrina α5β1, como biotinilação de proximidade em células vivas ou isolamento do ‘adesoma’. De todos os candidatos que interagem com a integrina α5β1, alguns são proteínas que estão localizadas em organelos intracelulares envolvidos no tráfico retrógrado de proteínas transmembranares, como o complexo de Golgi ou diferentes proteínas endossomais. Torna-se cada mais evidente que o tráfego de integrinas pela via endossomal ou via retrograda afetam significativamente a sua função, a sua distribuição polarizada à superfície da célula, as propriedades sinalizadoras de fatores de crescimento associados às integrinas e o turnover de proteínas da matriz extracelular (ECM) como a fibronectina (FN). O objectivo do trabalho desta tese de mestrado é confirmar as interacções de possíveis proteínas citosólicas com a integrina α5β1, determinar a sua localização subcelular e analisar processos que sejam mediados por integrinas tais como, adesão celular, espalhamento e migração em condições de perda-de-função destas mesmas proteínas. Começamos por confirmar a existência de um complexo trimérico entre a Fam91a1, WDR11 e C17orf75 no complexo de Golgi e cuja estabilidade está dependente da Fam91a1. Este complexo trimérico está envolvido no tráfico retrógrado visto que a sua ausência inibe o transporte de CI-M6Pr e TGN46 para a rede trans-Golgi (TGN), reduz os níveis de CI-M6Pr de forma semelhante a células sem retrómero e compromete a integridade da rede trans-Golgi. De relevar que o complexo Fam91a1/WDR11/C17orf75 é essencial para o tráfego intracelular da integrina α5β1 e para uma migração celular eficiente. Confirmamos o envolvimento dos complexos GARP e EARP no transporte retrógrado. Por fim, screenings da proteómica revelaram uma potencial associação entre o complexo Fam91a1/WDR11/C17orf75 e autofagia, sinalização endocítica e desenvolvimento da puberdade. No geral, os resultados obtidos neste projeto mostram que um complexo composto por Fam91a1/WDR11/C17orf75 que interage com a integrina α5β1, tem um papel muito importante no tráfego retrógrado mediado pela rede trans-Golgi da integrina α5β1, na migração celular e possivelmente serve de mediador de outros processos celulares chave, como a autofagi