Phosphoinositide 3-kinase inhibition another step in the quest to cure hematological malignancies

Trabalho final de mestrado integrado em medicina área cientifica de Biologia Molecular aplicada/Hematologia, apresentada á Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraA fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) é uma proteína que intervém em diversas vias de sinalização intracelular, e uma vez ativada conduz à ativação de vias efetoras como a PI3K/AKT/mTOR. A PI3K tem um papel muito importante em vários processos como crescimento, sobrevivência, proliferação, metabolismo, motilidade e transcrição de ADN. A desregulação desta via está associada à patogénese de processos neoplásicos incluindo neoplasias hematológicas. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito do Buparlisib, NVP-BKM120, de ora em diante designado por BKM120, um inibidor da Classe I do PI3K em modelos in vitro de leucemia mieloide aguda (LMA) e mieloma múltiplo (MM). Para concretizar o nosso objetivo utilizámos dois modelos de LMA, as células HEL (eritroleucemia) e as células NB-4 (leucemia promielocítica aguda) e um modelo de MM, as células H929. As linhas celulares foram cultivadas na ausência e na presença de diferentes concentrações de BKM120 que foi testado em esquemas de administração única e de administração diária. A viabilidade celular foi avaliada às 24, 48 e 72 horas de exposição utilizando um ensaio metabólico da resazurina. A morte celular foi analisada através de microscopia ótica (coloração May-Grunwald Giemsa) e por citometria de fluxo (CF) (anexina V e o iodeto de propídio). Também por CF foi avaliada a actividade das caspases (sonda ApoStat) e o ciclo celular através da marcação com Iodeto de Propídio/RNase. Os resultados demonstram que o BKM120 induz diminuição da proliferação celular de modo dependente do tempo, da dose, da linha celular e do esquema de administração. De facto, o IC50 calculado às 48h de exposição foi de 80 nM para a linha celular NB-4, revelando-se a mais sensível; 2 μM para a linha celular HEL e superior a 10 μM, a dose mais alta testada, para a linha celular H929. A administração diária de BKM120 mostrou-se mais eficaz na redução da proliferação celular que a mesma dose em toma única, particularmente na linha celular NB- Phosphoinositide 3-kinase inhibition, another step in the quest to cure hematological malignancies 4. A morfologia e a CF mostram que este composto induziu morte celular predominantemente por apoptose, com aumento da percentagem de células que expressavam caspases. A análise do ciclo celular permitiu verificar que o BKM120 induziu bloqueio do ciclo celular em todas as linhas celulares testadas provando que também tem efeitos anti-proliferativos. Os nossos resultados mostram que o BKM120 induz efeitos citotóxicos e anti-proliferativos em linhas celulares de LMA e de MM sugerindo que o PI3K pode ser um alvo promissor para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento destas neoplasias particularmente no caso da LMA.The phosphoinositide 3-kinase (PI3K) is an intermediate signaling molecule that is involved in the activation of multiple effector pathways such as PI3K/AKT/mTOR. PI3K plays a very important role in key cellular processes like cell growth, survival, proliferation, metabolism, motility and DNA transcription. This pathway is deregulated in several types of malignancies including hematological malignancies. The aim of this study is to evaluate the effect of Buparlisib, NVP-BKM120, hereby called BKM120 (a pan-class I PI3K inhibitor), on in vitro models of acute myelogenous leukemia (AML) and multiple myeloma (MM). For this purpose, we used two in vitro models of myeloid malignancies, HEL cells (erythroleukemia) and NB-4 cells (acute promyelocytic leukemia) and an in vitro model of lymphoid malignancies, H929 cells (MM). Cell lines were cultured both in absence and in presence of different concentrations of BKM120 administered in single and daily dose schemes. Cell viability was determined at 24, 48 and 72 hours using the resazurin assay. Cell death was analyzed by optical microscopy after May-Grunwald Giemsa staining, and by flow cytometry (FC) using the annexin V and propidium iodide double staining. Caspases activity was evaluated using the ApoStat probe by FC. Cell cycle analysis was also performed by FC with PI/RNAse solution. BKM120 induces a decrease in cell viability in a dose, time, cell-type and administration scheme dependent manner. In fact, the calculated half maximal inhibitory concentration (IC50) at 48 hours of exposure was 80 nM in the NB-4 cell line, making it the most sensible cell line, approximately 2 μM in the HEL cell line and well beyond 10 μM, the maximal dose tested, in the H929 cell line. Moreover, the daily administration of a small dose of BKM120 reveals a positive effect when compared to the administration of the same dose in the single dose Phosphoinositide 3-kinase inhibition, another step in the quest to cure hematological malignancies Abstract | 6 administration scheme, being this effect more pronounced in the NB-4 cell line. Morphology and FC demonstrated that this compound induced cell death predominantly by apoptosis with an increase of the percentage of cells expressing caspases. The cell cycle analysis showed that BKM120 induces cell cycle arrests in the tested cell lines proving that it also has anti-proliferative properties. Our results show that BKM120 has the ability to induce cytotoxic and anti-proliferative effects in acute myeloid leukemia and multiple myeloma cell lines, suggesting that PI3K could be a promising therapeutic target for novel anti-cancer therapeutics in patients with these malignancies, mainly with acute myeloid leukemia