Development of an in vitro model of a human Blood Brain Barrier for pharmacological studies : Interactions with directs oral anticoagulants

La barrière hémato-encéphalique (BHE) contrôle le passage des médicaments, en partie par la présence d’ATP Binding Cassette (ABC) transporteurs. Dans de nombreuses pathologies cérébrales, la BHE est altérée. Parmi elles, les hémorragies intracérébrales (HIC), qui sont un effet iatrogène des anticoagulants. Des analyses cliniques montrent que les patients sous Anticoagulants Oraux Directs (AODs) présentent moins d’HIC que les patients traités avec les anticoagulants de référence, les anti-vitamine K (AVK), sans que les mécanismes cellulaires soient élucidés. Une des différences entre les AODs et les AVK résident dans leur profil pharmacocinétique, effectivement, les AODs sont des substrats des ABC transporteurs contrairement aux AVKs. Au cours des HIC, la thrombine est activée et entraine une altération de la BHE par clivage et des récepteurs protease activated receptor (PAR). Les objectifs de ce travail de thèse ont été de mettre en place un modèle in vitro de BHE afin d’étudier les interactions des médicaments avec les ABC transporteurs. Ensuite, le modèle est utilisé pour étudier les interactions des AODs en condition pathologique. Le modèle développé est basé sur la lignée HBEC-5i, peu décrite dans la littérature. Les cellules ont été cultivées en monocouche sur insert avec milieu conditionné issu d’astrocytes humains. Le modèle permet l’étude de l’interaction de thérapeutiques avec des ABC transporteurs par des mesures d’efflux ratios. Le modèle a été validé par des études de transport de molécules pharmacologiques. Ensuite, nous avons comparé, sur notre modèle, les effets de l’exposition à la thrombine avec ou sans prétraitement d’anticoagulants (rivaroxaban, dabigatran, apixaban, warfarine et héparine). Les AODs limitent l’ouverture de la BHE induite par la thrombine contrairement aux autres anticoagulants. Nos résultats ont montré que l’altération de la BHE est médiée par le clivage du récepteur PAR-1 par la thrombine. Ce clivage n’est pas le même en fonction de la classe d’anticoagulants utilisée, les AODs minimisant ce clivage. L’ensemble de ce travail de thèse a permis de donner des premières explications cellulaires quant aux mécanismes d’ouverture de la BHE consécutifs aux HIC sous AODs.The blood-brain barrier (BBB) controls the passage of drugs, in part through the expression of the ATP Binding Cassette (ABC) transporters. In many brain diseases, the BBB is altered. Among them, intracerebral haemorrhages (ICH), which are an iatrogenic effect of anticoagulants. Clinical analyses show that patients with Direct Oral Anticoagulants (DOACs) treatment have less HIC than patients treated with the reference anticoagulants, Vitamin K Antagonist (VKA), without understanding the cellular mechanisms. One of the differences between DOACs and VKA lies in their pharmacokinetic profile, indeed, DOACs are substrates of ABC transporters unlike VKA. During HIC, thrombin, is activated and causes alterations in the BBB by the cleavage of the protease activated receptor (PAR). The objectives of this thesis work were first to set up an in vitro model of the BBB in order to study the passage of drugs and their interactions with ABC transporters. In a second step, the model is used to study the interactions of DOACs in pathological conditions. The model developed is based on the HBEC-5i cell line seldom described in the literature. The cells were cultured in monolayer on insert with conditioned medium from human astrocytes. It allows the study of the interaction of therapeutics with ABC transporters by measuring efflux ratios. The model has been validated by transport studies of pharmacological molecules. In order to meet our second objective, we compared the effect of thrombin exposure with or without pretreatment with anticoagulants (rivaroxaban, dabigatran, apixaban, warfarin and heparin sodium) on our model. DOACs limit the BBB damage induced by the thrombin unlike other anticoagulants. Our results showed that alteration of the BBB is mediated by the cleavage of the PAR-1 receptor by thrombin. This cleavage is not the same depending on the class of anticoagulants used, DOACs minimizing this cleavage. All this thesis work made it possible to provide the first cellular explanations of the opening mechanisms of the BBB following HIC under DOACs