Combinatorial diversity of two-pore-domain k+ channels and its involvement in migraine

Le maintien d'un potentiel de membrane de repos négatif est à la base de l'excitabilité neuronale. Ce potentiel négatif est généré par un courant de fuite de potassium induit par les canaux potassiques à deux domaines pore (K2P). Ils se sont révélés impliqués dans de nombreux mécanismes physiologiques et physiopathologiques tels que la dépression, la neuroprotection contre les ischémies, l'anesthésie, la migraine et la perception de la douleur. L'hétéromultimérisation est un mécanisme couramment utilisé dans la nature pour augmenter la diversité fonctionnelle des complexes protéiques. Par exemple, avec 15 gènes classés en 6 sous-familles, les canaux K2P pourraient générer 120 combinaisons et, en théorie, chacune d’elles possèderait des caractéristiques bien distinctes. Ici, nous avons d’abord étudié la capacité des membres de la même sous-famille K2P (sous-famille TREK) à s’assembler pour former des hétéromères fonctionnels dotés de nouvelles propriétés. En alliant l’optopharmacologie, une technique de précipitation de molécules uniques (SiMPull) et une technique de co-localisation à l’échelle de la molécule unique à la membrane plasmique, nous avons déterminé l’existence ainsi que la stœchiométrie des complexes créés entre TREK1, TREK2 et TRAAK. Nous avons caractérisé fonctionnellement les hétérodimères et avons constaté qu'ils formaient tous des canaux sélectifs au potassium rectifiant vers l'extérieur avec une sensibilité à la tension et aux pH variables. Ayant constaté que l’hétéromérisation est possible dans la même sous-famille, nous nous demandons si cela peut être fait entre membres de familles différentes et quelles pourraient en être les conséquences pathophysiologiques. Nous avons trouvé que TREK1 et TREK2 sont capable d’hétéromériser avec le canal plus distant TRESK, un canal K2P impliqué dans la migraine. Chez l'homme, la mutation TRESK-MT, une délétion de 2 paires de base (F139WfsX24) qui induit la formation de TRESK-MT1, un dominant négatif de TRESK, a été corrélé à la migraine. De manière surprenante, nous avons découvert que cette délétion induit un site alternatif de traduction (fsATI), menant à la formation d’un second fragment de TRESK, TRESK-MT2 qui s’assemble spécifiquement avec TREK1 et TREK2. Cet assemblage induit l’extinction des courants TREK, ce qui va augmenter l’excitabilité des neurones trijumeaux, une composante clé dans l’induction de la migraine, à l’origine du phénotype migraineux observé. Ensemble, ces résultats démontrent que l’hétéromérisation des canaux K2P n’est pas rare et doit être considérée pour comprendre leurs fonctions pathophysiologiques. Enfin, les analyses génétiques des mutations liées à des pathologies devraient désormais prendre en compte les fsATI.Maintenance of a negative resting membrane potential underlies the basis of neuronal excitability. This negative potential is generated by a potassium leak current mediated by two-pore-domain potassium channels (K2P). Over the years, they have been shown to be involved in many physiological and pathophysiological mechanisms such as depression, neuroprotection, anesthesia, migraine and pain perception. Heteromultimerization is a mechanism commonly used to increase the functional diversity of protein complexes. For example, with 15 genes classified in 6 subfamilies, the K2P channel family can potentially generates 120 combinations and, in theory, each of them would show different functional properties. Here, we first investigated the ability of the members from the same K2P subfamily (TREK subfamily) to assemble and form functional heteromeric channels with novel properties. Using single molecule pulldown (SiMPull) from HEK cell lysates, subunit counting in the plasma membrane of living cells and opto-pharmacology, we show that the TREK channel members TREK1, TREK2, and TRAAK readily co-assemble. We functionally characterized the heterodimers and found that all combinations form outwardly rectifying potassium-selective channels but with variable voltage sensitivity and pH regulation. Having found that heteromerization is possible within the same subfamily we wonder if it can happen between members from different subfamilies with lower sequence homology and what could be the pathophysiological consequences. We found that TREK1 and TREK2 are able to heterodimerize with the distantly-related TRESK, a two-pore-domain K+ channel implicated in migraine. Notably, in humans, TRESK-MT, a 2 bp frameshift mutation (F139WfsX24), which induced the formation of TRESK-MT1 a dominant negative for TRESK, was found to perfectly segregate with typical migraine in a large pedigree. Strikingly, we found that the 2 bp frameshift mutation induced an alternative translation initiation (fsATI) which leads to the translation of a second TRESK fragment, termed TRESK-MT2. We show that by co-assembling with and inhibiting TREK1 and TREK2, TRESK-MT2 increases trigeminal sensory neuron excitability, a key component of migraine induction, leading to a migraine-like phenotype. Together these findings demonstrate that K2P heteromerization is not rare and needs to be considered to understand their pathophysiological functions and that genetic analysis of disease-related mutations should consider fsATI as a distinct class of mutations