Caractérisation moléculaire et fonctionnelle de la pseudo-tyrosine kinase-like (pTKL) de plasmodium

Malaria is the first endemic parasitic disease in the world with nearly half million deaths in 2017 according to the WHO. This disease is the result of an infection by an agent belonging to the Plasmodium genus. This apicomplexan parasite infects two hosts over its complex life cycle: a definitive one – a mosquito belonging to the Anopheles genus – and a homoeothermic intermediate host. At least six Plasmodium species can infect humans. In its intermediate host, Plasmodium first replicates in hepatocytes before releasing erythrocyte-infectious stages in the bloodstream. Once there, parasites invade and replicate within erythrocytes, before lysing them to release other infectious stages. This triggers an exponential rise in the parasitemia, as well as malaria symptoms. Sexual stages, called gametocytes, are produced over this intra-erythrocytic cycle to be transmitted to the arthropod vector, thus allowing the completion of the parasite life cycle.Plasmodium co-evolved with its hosts and set up diverse gene expression regulation pathways accordingly. Phosphorylation is one of the major and fastest post-translational modifications used by the parasite to respond to environmental changes. Many of its kinases and phosphatases play key roles in host cell invasion, cellular growth and division, as well as motility of specific developmental stages. However, the role of the five pseudo-kinases expressed by Plasmodium has not been explored yet.During my PhD project, I have performed the characterization of the unique Plasmodium pseudo-Tyrosine Kinase-like (pTKL) and explored its role over the parasite intra-erythrocytic cycle.P. falciparum pTKL (PfpTKL) in silico annotation allowed the delineation of the protein domains. Notably, a SAM (Sterile Alpha Motif) domain, two RVxF motifs (known for their binding potential with the major protein phosphatase type 1, PP1) and a pseudo-kinase domain belonging to Tyrosine Kinase-like (TKL) family were found. This pseudo-kinase domain was found to be able to bind ATP in a cation-independent way although devoid of kinase activity. Two parasite protein partners of PfpTKL have been identified using in vitro protein-protein interaction studies together with heterologous models (yeast, Xenopus ovocytes). First, PfSERA5 (SErine Repeat Antigen 5) specifically and strongly interacts with PfpTKL SAM domain and second, PfPP1c binds the two RVxF-containing regions of PfpTKL. Interestingly, the second RVxF motif, which is located within the pseudo-kinase domain, directly binds PfPP1c and seems to be involved in the allosteric regulation of the phosphatase activity. The subcellular localization of P. berghei pTKL (PbpTKL) was studied by IFA as well as sequential lysis of erythrocytes followed by immunoprecipitation assays. PbpTKL was shown to be exported to the host cell cytosol at the trophozoite stage, but retained in the parasitophorous vacuole and the parasite cytosol at the schizont stage. Furthermore, our interactome analysis conducted at the trophozoite stage by IP/MS showed that PbpTKL binds many host cell proteins involved in erythrocyte cytoskeleton organization, as well as erythropoiesis and cell homeostasis. These data suggest that pTKL plays a role at the parasite/host interface, either directly or via its protein partners.Finally, in an attempt to understand the role of pTKL for the parasite development, we generated genetically modified P. berghei strains. The phenotypic study of PbpTKL KO and iKD strains did not show any difference between the defective parasites and the parental wild type ones during the intra-erythrocytic cycle, gametocyte expression and male gametocyte activation. These data suggest the dispensability of pTKL or the expression of redundant gene(s) with similar functions in these parasite stages. Whatever the explanation, it is still important to follow up this investigation in other parasite stages, from zygotes to hepatic stages.Le paludisme, première endémie parasitaire mondiale ayant engendré près d’un demi-million de morts en 2017 (d’après l’OMS), est due à une infection par un parasite du genre Plasmodium. Cet apicomplexe infecte, au cours de son cycle de vie, un hôte définitif, un moustique femelle du genre Anopheles, et un hôte intermédiaire homéotherme (l’Homme pour au moins 6 espèces). Chez ce dernier, après une phase de développement hépatique, le parasite envahit puis lyse les érythrocytes. L’accroissement exponentiel de la parasitémie engendre les symptômes du paludisme et permet la production de formes sexuées (gamétocytes) qui seront transmises au vecteur arthropode, permettant ainsi la complétion du cycle de vie du parasite.Plasmodium a co-évolué avec ses hôtes et mis en place divers modes de régulation de l’expression de ses gènes. La phosphorylation est l’une des modifications post-traductionnelles majeures et rapides qu’il utilise pour répondre aux changements environnementaux auxquels il est confronté au cours de son cycle de vie. Nombre de ses kinases et phosphatases jouent un rôle essentiel dans l’invasion de cellules hôtes, la croissance et la division cellulaires, ainsi que la motilité de certains stades. En revanche, le rôle des cinq pseudokinases de Plasmodium dans son développement n’a jusqu’ici pas été exploré.Durant ma thèse, j’ai caractérisé l’unique pseudo-Tyrosine Kinase-like (pTKL) de Plasmodium et étudié son rôle au cours du cycle intra-érythrocytaire du parasite.L’annotation de la pTKL de P. falciparum (PfpTKL) m’a permis d’identifier différents domaines et motifs, et notamment un domaine SAM (Sterile Alpha Motif), deux motifs RVxF (connus pour leur capacité d’interaction avec la Protéine Phosphatase de type 1, PP1) et un pseudo-domaine kinase appartenant à la famille des Tyrosine Kinases-like (TKL). Nous avons montré que ce pseudo-domaine kinase est capable de lier l’ATP de manière cation-indépendante, mais est dépourvu d’activité enzymatique. Des études d’interaction in vitro couplées à l’utilisation de modèles hétérologues (Levure, ovocytes de Xénope) m’ont permis d’identifier deux protéines parasitaires partenaires de PfpTKL : le domaine SAM de PfpTKL interagit directement avec la pseudo-protéase PfSERA5 (SErine Repeat Antigen 5), alors que les deux régions de la protéine contenant les motifs RVxF de PfpTKL interagissent avec PfPP1c (phosphatase majeure de Plasmodium). De façon intéressante, le deuxième motif RVxF est directement impliqué dans l’interaction avec PP1c et serait capable de moduler l’activité de cette dernière de manière allostérique.La localisation de la pTKL de P. berghei (PbpTKL) a ensuite été étudiée par immunofluorescence et confirmée par des expériences de fractionnement cellulaire. Nous avons ainsi observé que PbpTKL est exportée dans l’érythrocyte infecté au stade trophozoïte, puis retenue dans le parasite et la vacuole parasitophore au stade schizonte. L’étude de l’interactome de PbpTKL par IP/MS au stade trophozoïte a montré que PbpTKL s’associe à diverses protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette de l’érythrocyte, ainsi que dans l’érythropoïèse et l’homéostasie cellulaire. Ces observations suggèrent que pTKL joue un rôle, direct ou via ses partenaires, à l’interface entre le parasite et sa cellule hôte.Enfin, afin d’approcher la fonction de pTKL chez le parasite, nous avons généré différentes lignées génétiquement modifiées. L’étude phénotypique des souches de P. berghei KO et iKD pour pTKL a montré qu’elle était dispensable pour la complétion du cycle intra-érythrocytaire, l’expression des gamétocytes ainsi que l’activation des gamétocytes mâles. Ces données suggèrent que pTKL est dispensable pour ces stades de développement ou que l’expression de gènes redondants compense son absence. Quoi qu’il en soit, il est important de poursuivre les recherches sur le rôle de cette protéine aux autres stades de développement du parasite, notamment du zygote aux stades hépatiques