Novos produtos biotecnológicos e serviços para a indústria dos vinhos

Tese de Doutoramento em Ciências (Especialidade em Biologia)A principal finalidade deste doutoramento em empresa foi diversificar os produtos e serviços da Vinalia dirigidos à indústria vitivinícola, através do desenvolvimento de soluções sustentadas no setor da biotecnologia de leveduras. Com este trabalho procurou-se desenvolver serviços inovadores de tipagem molecular de leveduras, implementando-se métodos rápidos e especializados com aplicação nesta indústria. Pretendeu-se ainda explorar a biodiversidade de estirpes com potencial enológico, isoladas em diferentes regiões vitivinícolas portuguesas, e a sua utilização na produção de vinhos de elevada qualidade. A abordagem principal para a obtenção de novas estirpes de leveduras para aplicação enológica tem sido centrada na exploração da diversidade presente nos ambientes vitivinícolas. Os estudos da diversidade inter- e intraespecífica de leveduras envolvem geralmente a análise genotípica de um grande número de amostras biológicas, sendo necessário métodos eficientes para o rápido isolamento de DNA. Desta forma, foi desenvolvido e validado um método de extração de DNA, baseado num formato de microplacas de 96 poços, para Saccharomyces cerevisiae e outras espécies de leveduras. A gama de concentrações do DNA obtido variou entre 20 a 50 ng/mL, o que permitiu a utilização direta nas amplificações por PCR para os métodos de tipagem molecular usados na identificação de leveduras e na delimitação de estirpes de S. cerevisiae. O protocolo miniaturizado de extração de DNA permitiu o processamento manual de 16 microplacas (1536 isolados) num dia de trabalho. O custo dos consumíveis e reagentes foi significativamente inferior ao associado às opções disponíveis comercialmente. A colheita de 66 amostras de uvas, de diferentes castas, em seis regiões vitivinícolas portuguesas (Vinhos Verdes, Dão, Douro, Bairrada, Tejo e Alentejo), permitiu obter 1500 isolados de leveduras. Recorrendo à análise de sequências interdelta, diferenciaram-se 64 estirpes de S. cerevisiae, que foram submetidas a um programa de seleção tendo por fim a sua aplicação enológica. Os seguintes critérios foram sequencialmente analisados: duração da fermentação, perfil organolético, resistência ao dióxido de enxofre (SO2), tolerância ao etanol, fenómeno killer, produção de sulfureto de hidrogénio (H2S), atividade β-glucosidásica, e concentrações dos principais metabolitos (etanol, glicerol e ácido acético) no final da fermentação, assim como dos açúcares residuais (glucose e frutose). Neste procedimento foi selecionada uma estirpe (D3). Os testes à escala laboratorial, geralmente utilizados no processo de seleção de leveduras, não reproduzem com exatidão as fermentações à escala industrial. Assim, foi avaliado o comportamento fermentativo da estirpe D3 em vinificações à escala piloto e industrial. Foram vinificados oito mostos de castas de uvas brancas e quatro de uvas tintas, tendo-se verificado a implantação efetiva da estirpe D3 em todas elas. Em paralelo, foram realizados ensaios com uma levedura comercial (Lalvin QA23®) em três das castas de uvas brancas. As análises aos compostos voláteis dos três vinhos produzidos em paralelo revelaram que apenas nos vinificados com a estirpe D3, o 9-decenoato de etilo estava presente em teores superiores ao limiar de perceção. A análise sensorial evidenciou um aroma frutado mais intenso no vinho produzido com a levedura D3 relativamente ao obtido com a comercial. Os resultados indicaram que a formação de concentrações significativas deste éster, que confere um aroma frutado, é considerada como uma característica metabólica desta estirpe. No âmbito deste trabalho realizou-se a análise das características enológicas de seis populações de estirpes de S. cerevisae, correspondentes aos isolados obtidos em seis regiões vitivinícolas. Este estudo teve por objetivo avaliar se as estirpes da mesma população compartilhavam fenótipos adaptativos às condições ambientais específicas da sua região. As características fenotípicas (resistência ao SO2, tolerância ao etanol, fenómeno killer, produção de H2S, atividade β-glucosidásica e utilização da galactose como fonte de carbono) não apresentaram diferenças significativas entre as populações. A concentração dos metabolitos produzidos foi diversa, sugerindo que as estirpes utilizaram diferentes estratégias metabólicas para responder aos condicionalismos ambientais, independentemente da sua região de origem. Contudo, verificou-se que as microfermentações conduzidas mais rapidamente estavam associadas às leveduras pertencentes à região de proveniência do mosto. Esta observação suporta a hipótese de que as estirpes estão mais adaptadas às características dos mostos da sua área vitivinícola. Do trabalho reportado nesta tese de doutoramento resultou o know-how científico e técnico para a conceção de um serviço de isolamento, seleção e caracterização de leveduras enológicas autóctones. Foi constituída uma coleção de 64 estirpes de S. cerevisiae provenientes das principais regiões vitivinícolas portuguesas. Esta coleção representa um importante recurso biológico que a empresa pode explorar para diversificar a oferta de leveduras starter disponíveis no mercado. Por fim, vinificações à escala piloto e industrial conduzidas por uma estirpe isolada no âmbito desta tese, confirmaram as suas características enológicas diferenciadoras.The major aim of this doctorate in company was to diversify Vinalia’s products and services to the wine industry, through the development of solutions sustained in the yeast biotechnology sector. This work sought to develop innovative services of yeast molecular typing, by implementing quick and specialized methods with application in this industry. It was also intended to explore the strains biodiversity with oenological potential, isolated from several Portuguese wine regions, and its application in the production of high quality wines. The main approach to obtain new strains for oenological application has been centered on the exploitation of the yeast diversity present in wine environments. Studies of yeasts interand intraspecific diversity often encompasses genotypic analysis of a large number of biological samples and, therefore, efficient methods for the rapid isolation of DNA are required. Thus, a DNA extraction method, based on a 96 wells microplate format, was developed and validated for Saccharomyces cerevisiae and other yeast species. The range of DNA concentration obtained was between 20 and 50 ng/mL, which allowed the direct use in PCR amplifications for the general molecular typing methods used in yeast identification and S. cerevisiae strains delimitation. The miniaturized DNA extraction protocol allowed manual processing 16 microplates (1536 isolates) in one working day. The cost of consumables and reagents was significantly lower than that associated to the commercially available options. A 66 samples collecting of different grape varieties, in six Portuguese wine regions (Vinhos Verdes, Dão, Douro, Bairrada, Tejo and Alentejo), allowed gathering 1500 yeast isolates. Interdelta sequences analysis differentiated 64 S. cerevisiae strains, which were subjected to a selection program for oenological application purposes. The following criteria were sequentially analyzed: fermentation duration, organoleptic profile, resistance to sulfur dioxide (SO2), ethanol tolerance, killer phenomenon, hydrogen sulfide (H2S) production, β-glucosidase activity, and concentrations of major metabolites (ethanol, glycerol and acetic acid) at the end of the fermentation, as well as residual sugars (glucose and fructose). One strain (D3) was selected in this procedure. Laboratory scale tests, generally used in the yeasts selection process, do not reproduce accurately the fermentations at industrial scale. Thus, the fermentative performance of the strain D3 was evaluated at pilot and industrial wine fermentation scales. Eight musts of white and four of red grape varieties were vinified, and the effective implantation of the D3 strain was observed in all of them. In parallel, a commercial yeast (Lalvin QA23®) was tested in three of the varietal white musts. The analysis of the volatile compounds of the three wines produced in parallel revealed that only in the ones obtained with the strain D3, ethyl 9-decenoate was present at concentrations above the perception threshold. The sensory analysis showed that a more intense fruity aroma was detected in the wine produced with the D3 yeast in comparison to the wine obtained with the commercial starter. The results indicated that the formation of significant concentrations of this ester, which confers a fruity aroma, is regarded as a metabolic feature of this strain. The analysis of enological properties of six S. cerevisiae strains populations, respectively isolated from six wine regions, was accomplished in the scope of this work. This study aimed to assess whether the strains of the same population shared adaptive phenotypes specific to the environmental conditions of that region. The phenotypic characteristics (resistance to SO2, ethanol tolerance, killer phenomenon, H2S production, β-glucosidase activity and utilization of galactose as a carbon source) did not differ significantly between populations. The produced metabolites concentration was diverse, suggesting that the strains used different metabolic strategies to respond to environmental constraints, regardless of their region of origin. However, it was found that the fastest microfermentations were conducted by the yeasts belonging to the same wine region of the must. This observation supports the hypothesis that yeast strains might be better adapted to the must characteristics of its own vinicultural area. The work developed in this PhD thesis lead to scientific and technical know-how that allowed the designing of a service to isolate, select and characterize autochthonous wine yeasts. A collection of 64 strains of S. cerevisiae, from the main Portuguese wine regions, was established, representing an important biological resource. This collection can be exploited by the company to diversify the yeast starters offered on the market. Finally, pilot and industrial scale wine fermentations conducted by a strain selected in the scope of this thesis, have confirmed its distinctive oenological characteristics