Genetic diversity, resistance to sanitizers, biofilm formation and expression of adhesion genes in Staphylococcus aureus from milk

Staphylococcus aureus is the third microorganism most involved in foodborne diseases in Brazil. The ability to form biofilm on different surfaces of the food industry is a risk factor for the consumer, due to the possibility of contamination of food products. The aims of this study were to verify the genetic diversity, as well as to evaluate the capacity of biofilm formation and the expression of adhesion genes in S. aureus isolates from milk. In addition, it was aimed to determine the susceptibility profile to benzalkonium chloride and chlorhexidine sanitizers and to detect the presence of the main resistance genes to sanitizers in these isolates. The spa typing was used to evaluate genetic diversity. For evaluate the ability of biofilm formation, firstly polystyrene microplates were used to select different biofilm formation profiles. After this, nine isolates from different biofilm formation profiles (three poor biofilm producer, three moderate biofilm producer and three non-biofilm producers) were selected, and these were evaluated for their ability to form biofilm on stainless steel at temperatures of 7, 10 and 37 °C in Tryptone Soy Broth (TSB) and UHT milk. Realtime quantitative PCR (RT-qPCR) was used to evaluate the expression of adhesion genes (cna and ebpS). To verify the susceptibility to sanitizers benzalkonium chloride and chlorhexidine the broth microdilution method was used and the PCR was used to detect the main resistance genes to sanitizers. Of the 31 isolates of S. aureus evaluated, 18 (58%) produced exopolysaccharide. From the polystyrene evaluation, 14 isolates (45%) were able to produce biofilms on this surface. Of these, nine isolates with different biofilm formation profiles (weak biofilm producer, moderate biofilm producer and no biofilm producer) were selected to verify their ability to produce biofilm on stainless steel surface, and all isolates produced biofilms at temperatures of 7, 10 and 37 °C, in TSB and in UHT milk, independent of polystyrene formation profile. Regarding to the presence of the genes of adhesion fnbA, fnbB, clfB, ebpS and cna, were found in 48%, 3%, 52%, 80% and 62% of the isolates, respectively. The real-time quantitative PCR (RT-qPCR) technique showed variation in expression levels of the ebpS and cna genes; however, only in the C2 isolate at a temperature of 10 °C, there was a significantly higher expression of the two genes tested in relation to other multiplication temperatures. The isolates showed a resistance profile to benzalkonium chloride (90.3%) and chlorhexidine (100%); in addition, the mepA, norA and norB genes were the most prevalent, with frequencies of 77.4%, 80.6% and 100%, respectively. The spa type t127 was the most prevalent among the isolates, and this spa type has a very high genetic relation with isolates from human sources, being able to be the source of transmission of S. aureus to milk. The results obtained in the present study highlight the importance of monitoring S. aureus in the food industry environment, since this microorganism is able to form biofilm in different surfaces, temperatures and culture media and harbor phenotypic resistance and genotypic to sanitizers.Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPqStaphylococcus aureus é o terceiro micro-organismo mais envolvido em doenças transmitidas por alimentos no Brasil. A sua capacidade de formar biofilme em diferentes superfícies da indústria de alimentos é um fator de risco para o consumidor, devido a possibilidade de contaminação dos produtos alimentícios. Os objetivos deste estudo foram verificar a diversidade genética, avaliar a capacidade de formação de biofilme e a expressão de genes de adesão em isolados de S. aureus provenientes de leite. Além disso, objetivou-se determinar o perfil de suscetibilidade a sanitizantes e detectar a presença de genes de resistência a sanitizantes. A técnica de spa typing foi utilizada para avaliar a diversidade genética. Para avaliação da capacidade de formação de biofilme foram utilizadas microplacas de poliestireno para selecionar diferentes perfis de formação de biofilme. Após foram selecionados nove isolados de diferentes perfis de formação de biofilme (três fracos formadores de biofilme, três moderados formadores de biofilme e três não formadores de biofilme) e estes foram avaliados quanto a sua capacidade de formar biofilme em aço inoxidável nas temperaturas de 7, 10 e 37 °C em caldo Triptona de Soja (TSB) e leite UHT. Foi utilizada a técnica de PCR quantitativa em Tempo Real (RT-qPCR) para avaliar a expressão dos genes de adesão (cna e ebpS). Para verificar a suscetibilidade aos sanitizantes cloreto de benzalcônio e clorexidina utilizou-se o método de microdiluição em caldo e PCR para detectar genes de resistência a sanitizantes. Dos 31 isolados de S. aureus avaliados, 18 (58%) produziram exopolissacarídeo. Pela avaliação em poliestireno, verificou-se que 14 isolados (45%) apresentaram capacidade de produzir biofilmes nessa superfície. Dos nove isolados selecionados com diferentes perfis de formação de biofilme verificou-se que todos produziram biofilme em aço inox em todas temperaturas e meios de cultivo testados, independente de seu perfil de formação de biofilme em poliestireno. Com relação à presença dos genes de adesão, os genes fnbA, fnbB, clfB, ebpS e cna, foram encontrados em 48%, 3%, 52%, 80% e 62% dos isolados, respectivamente. A RT-qPCR revelou variação nos níveis de expressão dos genes ebpS e cna, entretanto, apenas no isolado C2, na temperatura de 10 °C, houve expressão significativamente maior dos dois genes testados em relação as demais temperaturas de multiplicação. Os isolados apresentaram perfil de resistência ao cloreto de benzalcônio (90,3%) e a clorexidina (100%); além disso, os genes mepA, norA e norB foram os mais prevalentes, com frequências de 77,4%, 80,6% e 100%, respectivamente. O spa type t127 foi o mais prevalente entre os isolados, sendo que esse spa type apresenta uma relação genética com isolados de origem humana, podendo ser a fonte de transmissão de S. aureus para o leite. Os resultados obtidos no presente estudo ressaltam a importância do monitoramento de S. aureus no ambiente da indústria de alimentos, uma vez que este micro-organismo é capaz de formar biofilme em diferentes superfícies, temperaturas e meios de cultivo e apresenta resistência fenotípica e genotípica a sanitizantes