An epigenetic role for Pramel7 in pluripotent stem cells

PRAME-like genes (Preferentially expressed antigen in melanoma-like, Pramel) share structural similarities with the human cancer-testis antigen (CTA) PRAME. CTAs are usually expressed in a variety of cancers and in germ cells. In the mouse, 18 members of the PRAME-like gene family have been suggested until now, but their molecular function is largely elusive. Expression of one member, Pramel7, was found in the pluripotent compartment of the mouse preimplantation embryo, the morula and the inner cell mass (ICM) of a blastocyst. During these early stages of development, a replication-coupled passive demethylation of the maternal genome is documented. When Pramel7 is overexpressed in mouse embryonic stem cells (mESCs), the pluripotent state of these cells can be maintained even in the absence of the cytokine LIF (leukemia inhibitory factor). Moreover, when mESCs overexpressing Pramel7 are exposed to differentiation cues, these cells show diminished differentiation capacity in vitro and in vivo. In mESCs, the expression of Pramel7 can be induced by the activation of the LIF/STAT3 signalling and Pramel7 was shown to be a direct downstream target of STAT3. However, the molecular function of Pramel7 is unknown. Here, we identify UHRF1 as a potent interaction partner of Pramel7 in HEK293T cells and mESCs. The epigenetic regulator UHRF1 (Ubiquitin-like containing PHD and RING finger domains, 1) mediates the faithful transmission of DNA methylation marks from mother to daughter cells during DNA replication. To achieve this, UHRF1 is able to recognize hemimethylated DNA and guide DNMT1 (DNA methyltransferase 1) to these sites. UHRF1 is also interacting with other epigenetic regulators such as HDAC1, G9a and PARP1 or the N-terminal tail of H3. Thus, this protein is considered to link DNA modification and the establishment of chromatin patterns. We show that a region containing LRRs (Leucine-rich repeats) in the C-terminal area of Pramel7 is critical for the interaction with UHRF1. Furthermore, the C-terminal part of UHRF1 containing SRA and RING domains significantly contributes to an efficient binding of the two proteins (Pramel7-UHRF1). In immunoprecipitation and mass spectrometry assays, we discover factors such as ElonginC, HP1γ, CHD4, SPT16, PARP1, different types of histones, Polyubiquitin and other epigenetic regulators as interaction partners of the Pramel7-UHRF1 complex, indicating a role for Pramel7 at chromatin sites. Of note, we find that overexpression of mouse Pramel7 leads to a rapid, dose-dependent and reversible decrease of endogenous UHRF1 protein levels in HEK293T (human UHRF1) and mESCs (mouse UHRF1). Furthermore, Pramel7 mutants with deletions in the LRR region are not able to provoke the degradation of wt (wild type) UHRF1. Recombinant forms of UHRF1 lacking the C-terminal part of the protein cannot be degraded by wt Pramel7. To summarize, UHRF1 protein degradation can be specifically mediated by its direct interaction with Pramel7 and occurs via the 26S proteasome. We demonstrate that ectopic expression of Pramel7 accompanied by a reduction of UHRF1 protein leads to drastically reduced levels of 5mC (5-methylcytosine) in mESCs. This has a significant influence on the behaviour of cells. In self-renewing conditions, mESCs overexpressing Pramel7 exhibit a more active epigenetic profile on a global scale shown by an enrichment of activating histone marks. This is corroborated by the aberrant upregulation of the trophectodermal marker Elf5 in Pramel7-overexpressing mESCs, a phenomenon also observed in mESCs with abrogated expression of the three main DNMTs. Differentiation of mESCs requires activation of differentiation factors and silencing of pluripotency-associated genes. DNA methylation is recognized as the ultimate epigenetic silencing mark. As a consequence of absent DNA methylation, we observe that Pramel7-overexpressing mESCs exhibit major limitations in terminal differentiation. After 14 days of differentiation and subsequent re-exposure to culture conditions maintaining pluripotency, Pramel7-overexpressing mESCs are able to reconvert to a complete pluripotent state and reactivate the expression of the classical pluripotency markers alkaline phosphatase, Oct4, Nanog and Rex1. This indicates that upon differentiation, the presence of Pramel7 impairs the capacity of mESCs to silence the pluripotency-associated genes. Under consideration of our mass spectrometry data, we establish a functional model where Pramel7 acts as a substrate recognition component of an E3 Cullin-RING ligase (CRL) complex. Binding of Pramel7 and UHRF1 is thought to induce the attachment of Ubiquitin to UHRF1 and finally to lead to proteasomal degradation of UHRF1. Taken together, for the first time, we demonstrate a biologically significant role for a member of the PRAME-like protein family. This model might support the understanding of the replication-coupled, passive DNA demethylation mechanism occurring during the preimplantation development of the mouse embryo. Gene der PRAME-like (Preferentially expressed antigen in melanoma-like, Pramel) Familie teilen strukturelle Ähnlichkeiten mit dem humanen Tumor-Hoden-Antigen PRAME. Tumor-Hoden-Antigene sind üblicherweise in einer Vielzahl von Krebsarten und in Keimzellen exprimiert. Bis anhin sind in der Maus 18 PRAME-like-Gene identifiziert worden, ihre molekularen Funktionen sind allerdings immer noch unbekannt. Pramel7, ein Mitglied der PRAME-like Familie, ist in den pluripotenten Kompartimenten eines frühen Mausembryos exprimiert, genauer in Morula und der inneren Zellmasse des Blastozysten. Während dieser frühen Phase der Embryonalentwicklung findet eine replikationsabhängige, passive Demethylierung des mütterlichen Genoms statt. Überexpression von Pramel7 in embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) erlaubt deren Propagierung auch ohne Zugabe des Cytokins LIF (leukemia inhibitory factor) zum Kulturmedium. Wenn Pramel7-überexprimerende mESCs zudem zur Differenzierung angeregt werden, zeigen sie eine verminderte Differenzierungskapazität in vitro und in vivo. In mESCs kann die Expression von Pramel7 durch Aktivierung des LIF/STAT3-Signalweges induziert werden, was Pramel7 zu einem nachgeordneten Zielgen des Transkriptionsfaktors STAT3 macht. Trotzdem ist die molekulare Funktion von Pramel7 immer noch unbekannt. In dieser Arbeit identifizieren wir UHRF1 als einen Interaktionspartner von Pramel7 in HEK293T Zellen und mESCs. Das epigenetische Regulatorprotein UHRF1 (Ubiquitin-like containing PHD and RING finger domains, 1) dient dazu, DNA-Methylierungsmarkierungen während der DNA-Replikation zuverlässig vom Genom der Mutterzelle auf die Genome der beiden Tochterzellen zu übertragen. Dabei erkennt UHRF1 Stellen hemimethylierter DNA und führt DNMT1 (DNA-methyltransferase 1) zu diesen Positionen. Neben DNMT1 interagiert UHRF1 auch mit anderen epigenetischen Regulatorproteinen wie HDAC1, G9a oder PARP1 und mit dem N-terminalen Ende von H3. UHRF1 ist somit in der Lage, eine Verbindung zwischen DNA-modifizierungen und dem Aufbau von Chromatinmustern herzustellen. Wir zeigen, dass eine Region im C-terminalen Teil von Pramel7 LRRs (Leucine-rich repeats) enthält und dass diese Region kritisch für eine erfolgreiche Interaktion mit URHF1 ist. Seitens UHRF1 trägt vor allem der C-terminale Teil, genauer SRA und RING Domänen, zur effizienten Bindung zwischen den beiden Proteinen bei. In Immunopräzipitationsexperimenten und massenspektrometrischen Untersuchengen identifizieren wir weitere potenzielle Bindungspartner des Pramel7-UHRF1 Komplexes, wie ElonginC, HP1γ, CHD4, SPT16, PARP1, verschiedene Histone, Polyubiquitin und andere epigenetische Regulatoren. Im Bezug auf Pramel7 könnte dies auf eine Rolle auf Chromatinebene hindeuten. Interessanterweise können wir aufzeigen, dass forcierte Expression des Mausproteins Pramel7 in HEK293T Zellen (human) und in mESCs (Maus) zu einer raschen, dosisabhängigen und reversiblen Degradation von endogenem UHRF1-Protein führt. Dabei sind Versionen von Pramel7 mit Mutationen (Deletionen) in der LRR-Region nicht in der Lage, die Degradation von wildtyp (wt) UHRF1 zu induzieren. Wiederum können mutierte Formen von UHRF1 (fehlender C-terminaler Teil inklusive SRA- und RING-Domänen) nicht durch Expression von wt Pramel7 degradiert werden. Zusammengefasst wird die Abnahme von UHRF1-Protein durch seine spezifische Interaktion mit Pramel7 vermittelt und erfolgt über den 26S-proteasomalen Degradationsweg. Als Konsequenz daraus finden wir in mESCs mit stabiler Überexpression von Pramel7 drastisch reduzierte 5mC-Levels (5-Methylcytosin). Dies hat weitreichende Konsequenzen auf das Verhalten dieser Zellen: Unter Kulturbedingungen, die Selbsterneuerung begünstigen, weisen Pramel7-überexprimierende mESCs ein erhöhtes Vorkommen aktivierender Histonmarkierungen auf. Ferner exprimieren diese Zellen den trophectodermalen Marker Elf5, der in wt mESCs normalerweise nur schwach aktiv ist, viel zu stark. Abnormale Überexpression von Elf5 kann auch in mESCs mit fehlender Expression aller DNMTs beobachtet werden. Ein erfolgreicher Differenzierungsprozess einer mESC erfordert die Aktivierung von Differenzierungsgenen und die Abschaltung von Pluripotenzgenen. Dabei spielt die DNA-Methylierung eine wichtige Rolle, so gilt sie doch als ultimative epigenetische Abschaltungsmarkierung. Als Konsequenz fehlender DNA-Methylierung können wir in Pramel7-überexprimierenden mESCs beobachten, dass ihre Fähigkeit terminal zu differenzieren stark eingeschränkt ist: Nach 14-tägiger Differenzierung und anschliessender Kultivierung unter Pluripotenz-fördernden Kulturbedingungen sind Pramel7-überexprimierende mESCs in der Lage, rasch wieder in ein pluripotentes Stadium überzugehen. Dabei werden mit Pluripotenz assoziierte Marker wie Oct4, Nanog und Rex1 wieder reaktiviert. Diese Anzeichen erhärten die Annahme, dass die Präsenz von Pramel7 während des Differenzierungsprozesses die Kapazität von mESCs, Pluripotenzgene auszuschalten, drastisch vermindert. Unter Berücksichtigung unserer Massenspektrometriedaten stellen wir ein funktionelles Modell auf, in dem Pramel7 die Rolle eines Substraterkennungsproteins in einem E3 Cullin-RING Ligase-Komplex einnimmt. Dabei wird angenommen, dass die Interaktion zwischen Pramel7 und UHRF1 zur Übertragung von Ubiquitinresten auf das UHRF1-Protein und schlussendlich zur Degradation desselben führt. Zusammengefasst präsentieren wir in dieser Arbeit zum ersten Mal überhaupt eine biologisch signifikante Rolle für ein Protein der PRAME-like-Familie. In vivo könnten unsere Beobachtungen einen Beitrag zum Verständnis der passiven, replikationsabhängigen Demethylierung des mütterlichen Genoms im frühen Mausembryo leisten