Diseño y evaluación de metodologías basadas en PCR-RFLP de ITS2 para la identificación molecular de mosquitos Anopheles spp. (Diptera: Culicidae) de la Costa Pacífica de Colombia

Introduction. Difficulties in anopheline identification due to intra-individual variation and interspecies similarity have led to the development of molecular tools that allow species discrimination Objective. To use bioinformatics tools to develop a PCR-RFLP assay for molecular identification of species belonging to the Oswaldoi Group reported in Colombia and to evaluate the usefulness of a PCR-RFLP-AluI assay previously developed in our lab, in anophelines from different Colombian localities. Material and Methods. In silico restriction patterns were generated by bioinformatics analysis of ITS2 sequences reported in GenBank, corresponding to species belonging to the Oswaldoi Group. To evaluate the PCR-RFLP-AluI assay we used mosquitoes collected in four localities of the Pacific Coast of Colombia: Nuquí, Pizarro, Buenaventura and Tumaco. Results. Bioinformatic analysis of reported ITS2 sequences showed that the enzyme AluI produced in silico restriction patterns that distinguished four species belonging to the Oswaldoi Group; two additional species could be differentiated with a second digest. The evaluation of the PCRRFLP-AluI confirmed results of morphological identifications and demonstrated identification problems that can arise due to intraspecific variation and interspecies similarity. Conclusions. The expansion of the PCR-RFLPAluI methodology and its application in different regions of the country will allow rapid and accurate discrimination of a large number of mosquitoes, some of them belonging to species that are difficult to discriminate morphologically. This strategy will be useful for complementary studies to assess malaria transmission dynamics in Colombia.Introducción. La dificultad en la identificación de especies anofelinas, debido a la variación intraindividual y similitud interespecífica, ha conducido al desarrollo de herramientas moleculares que permitan la discriminación de especies. Objetivo. Utilizar herramientas bioinformáticas para desarrollar una PCR-RFLP in silico que permita la identificación molecular de especies pertenecientes al Grupo Oswaldoi registradas en Colombia, y evaluar la utilidad de la PCR-RFLPAluI desarrollada previamente en nuestro laboratorio, en anofelinos de diferentes localidades. Material y Métodos. Se realizó un análisis bioinformático utilizando las secuencias ITS2 del Grupo Oswaldoi reportadas en GenBank, para generar patrones de restricción in silico que permitieran discriminar estas especies. Para evaluar la PCRRFLP-AluI se utilizaron mosquitos colectados en las localidades de Nuquí, Pizarro, Buenaventura y Tumaco, en la Costa Pacífica de Colombia. Resultados. El análisis bioinformático mostró que la enzima AluI produjo patrones de restricción in silico diferentes para cuatro especies del Grupo Oswaldoi; dos especies más podrían distinguirse con una segunda digestión. La PCR-RFLPAluI permitió confirmar los resultados de la identificación morfológica y evidenciar algunos problemas de identificación que surgen debido a la variación intraespecífica y similitud interespecie. Conclusiones. La ampliación de la estrategia de PCR-RFLP-AluI y su aplicación en diferentes zonas del país, permitirá la discriminación rápida y confiable de un mayor número de mosquitos, entre los cuales se encuentran especies de difícil discriminación morfológica. Esta estrategia será de utilidad para el desarrollo de estudios complementarios que permitan un mayor acercamiento al entendimiento de la dinámica de la transmisión de malaria en Colombia