PCR-RFLP como diagnóstico molecular para doença de Alzheimer

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação)(INTRODUÇÃO) A doença de Alzheimer (DA) e' um tipo de demência caracterizada pela degeneração progressiva e seletiva das populações de neurônios no córtex entorrinal, no hipocampo, nos córtices de associação de ordem superior das regiões temporal, frontal e parietal. Foi descrita em 1907 pelo médico neuropatologista alemão Alois Alzheimer ao demonstrar a presença de placas senis em cérebros de pacientes acometidos de demência senil. O caráter genético começou a ser estudado em 1963 por Lorsson e Sjogren ao verificarem maior frequência em familiares quando comparado a população. Estudos recentes têm demonstrado mutações em três genes: APP, PSl e PSZ nos cromossomos 21, 14 e 1 respectivamente. O primeiro fator genético correlacionado à DA foi o gene para apolipoproteína-E (apoE) presente no cromossomo 19. Estudos revelam sua associação com a proteína-[3 arniloide sugerindo atividade na remoção de placas senis. Especula—se que a apoE também atue no metabolismo e transporte de colesterol no cérebro, por possuir distintos receptores hepáticos de lipoproteínas (receptor LDL e receptor ApoE). Trabalhos tem mostrado que o alelo 84 é responsável por mais de 50% dos casos de demência do tipo Alzheirmer acima de 65 anos, contudo ainda não é plenamente conhecido O mecanismo que envolve a apoE com a DA. O diagnóstico para a DA e diferencial uma vez que só pode ser confirmado por análise histológica de tecido cerebral. Este trabalho propõese a otimizar a técnica de PCR-RFLP desenvolvida por Hixon e Vemier, 1990 para diagnóstico molecular para DA, uma vez que as condições de reação conhecidas não se aplicam a todas as situações. (METODOLOGIA) A reação de PCR foi otimizada empregando-se a metodologia proposta por Innis, 1990, na qual são estabelecidos parâmetro para as reações com diferentes concentrações de Mng, primers, DNA, Taq-polimerase, dNTPs e temperaturas de anelamento, desnaturação e extensão. (RESULTADO) Obteve—se melhor condições com Spmol de cada primer, 1.5mM de MgClz, lU de Taq-polimerase, lOOuM de dNTPs e 100—200ng de DNA para volume fmal de 30p.L. O programa da reação inicia-se a 95ºC por Smin, repetindo 35 ciclos de anelamento a 60ºC-4OS, extensão a 70ºC—40s e desnaturação a 94ºC-40s. O produto de 244pb e' submetido a digestão pela HhaI a 37ºC-3h. (CONCLUSÃO) Este trabalho mostra boa repetibilidade da metodologia empregada por Hixon assim como a possibilidade de genotipagem empregando gel de poliacrilamida 19:1, 8%, corado por prata, 0 que dispensa uso de material radioativo e biotina, diminuindo os riscos e custos ao laboratório