Salmonella Minnesota Isolated Poultry Production Chain: Virulence Genes, Biofilm Formation and Inhibition with Biocides

The Salmonella genus stands out for its high prevalence among the microorganisms most often found in outbreaks of foodborne diseases. Among the serovars, S. Minnesota, has been showing a constant growth in the number of isolations along the entire Brazilian poultry production chain and also in the European Union and the United States, which demonstrates its importance and the necessity to investigate the causes of its emergence to establish more effective control measures. The thesis was divided in three chapters, the first referring to the general considerations of the topics covered in the other chapters. The second chapter aimed to evaluate the presence of virulence genes and environmental adaptation in 20 strains of S. Minnesota, isolated in the years 2009, 2010 and 2014, in broiler slaughter plants of two Brazilian companies, in order to infer the risk potential that they represent, and also to establish the phylogenetic relationship among isolates. The presence of genes associated with apoptosis (avrA), oxidative stress (sodC), invasion (invA), adhesion-related (agfA), biofilm formation (lpfA) and quorum-sensing process (luxS) was evaluated. The virulence profiles generated showed that the strains are potentially pathogenic and PFGE showed great genetic diversity, with 14 pulse types, three of them with homology greater than 80%. The third chapter aimed to determine the Biofilm formation index (IFB) for the 20 strains of S. Minnesota at three temperatures (4ºC / 25ºC / 36ºC), as well as to investigate the action of the tallowing biocidal agents: 1% chlorhexidine, 1 % sodium hypochlorite and 0.8% peracetic acid in inhibition of formed biofilms. The results demonstrated that the ability of S. Minnesota to produce biofilm at different temperatures is variable and strain dependent, but temperatures of 25 and 36ºC are more favorable to their formation. All strains were resistant to 1% sodium hypochlorite whereas the use of peracetic acid and chlorhexidine demonstrated the same efficiency in reducing counts of resistant strains. The presence of tolerant strains to the biocides tested is of concern and suggests a possible expression of genes related to oxidative stress and / or exposure to sublethal concentrations in the poultry production environment, representing a real potential for the development of adaptation mechanisms. The inclusion of stricter measures to prevent the installation and to ensure the removal of S. Minnesota biofilms, coupled with monitoring protocols, should be a strategy in the poultry industry to ensure the safety of the food produced. Keywords: Biocides, Biofilms, Broiler, Gene, PFGE, Salmonellosis.Tese (Doutorado)O gênero Salmonella destaca-se pela alta prevalência entre os micro-organismos mais frequentemente incriminados em surtos de doenças transmitidas por alimentos. Dentre os sorovares, S. Minnesota vem apresentando um constante crescimento no número de isolamentos ao longo de toda cadeia de produção avícola brasileira e também na União Europeia e nos Estados Unidos, o que demonstra sua importância e a necessidade de investigar as características de sua emergência para estabelecer medidas de controle mais efetivas. A tese foi dividida em três capítulos, sendo o primeiro referente às considerações gerais dos tópicos abordados nos demais capítulos. O segundo capítulo objetivou avaliar em 20 cepas de S. Minnesota, isoladas nos anos de 2009, 2010 e 2014 em plantas de abate de frangos de corte de duas empresas brasileiras, a presença de genes de virulência e de adaptação ambiental para inferir o perigo potencial que representam, e também estabelecer a relação filogenéticapor PFGE entre os isolados. Foi avaliada a presença dos genes associados a apoptose (avrA), estresse oxidativo (sodC), invasão (invA), os ligados à adesão (agfA), à formação de biofilmes (lpfA) e ao processo de quorum-sensing (luxS). Os perfis de virulência gerados demonstraram que as cepas são potencialmente patogênicas e o PFGE demonstrou grande diversidade genética, com 14 pulsotipos, sendo três deles com similaridade maior que 80%. O terceiro capítulo objetivou determinar o índice de formação de Biofilme (IFB) para as 20 cepas de S. Minnesota em três temperaturas (4ºC/25ºC/36ºC), assim como, investigar a ação dos agentes biocidas clorexidina 1%, hipoclorito de Sódio 1% e ácido peracético 0,8% na inibição dos biofilmes formados. Os resultados demonstraram que a capacidade de S. Minnesota produzir biofilme nas diferentes temperaturas é variável e cepa dependente, mas que as temperaturas de 25 e 36°C são mais favoráveis à sua formação. Todas as cepas apresentaram resistência ao hipoclorito de sódio 1% enquanto que o uso de ácido peracético e cloroxidina demonstraram a mesma eficiência na redução das contagens das cepas resistentes. A existência de cepas tolerantes aos biocidas testados é preocupante e sugere uma possível expressão de genes relacionados ao estresse oxidativo e/ou a existência de exposição a concentrações subletais no ambiente de produção avícola, representando um potencial real para o desenvolvimento de mecanismos de adaptação. A inclusão de medidas mais rigorosas para impedir a instalação e para garantir a remoção de biofilmes de S. Minnesota, aliado a protocolos de monitoramento deve ser uma estratégia na indústria avícola para garantir a inocuidade do alimento produzido. Palavras-chave: Biocidas, Biofilmes, Frango de corte, Gene, PFGE, Salmonelose