Preparation of mouse monoclonal antobodies against cyclin-dependent kinase

Cieľom mojej diplomovej práce bola príprava monoklonálnej protilátky proti cyklin-dependetnej kináze 13 (CDK13). V teoretickej práci som sa zameral na väzbu antigén – protilátka, ktorá je podstatná práve pri využití monoklonálnych protilátok pri stanovení CDK13, ako aj transkripcii, ktorú táto kináza ovplyvňuje. Rovnako som sa venoval metódam Western blot a ELISA, na ktorých som založil detekciu novo vzniknutých protilátok. V teoretickej časti som následne zmienil aj protilátky a definíciu antigénu, na ktorú som nadviazal svoje výsledky v diskusii. V praktickej časti som sa venoval príprave antigénu – jeho izolácii a purifikácii na peristaltickej pumpe. Ďalej som sa venoval imunizácii, jej priebehu a množstvu antigénu použitého na imunizáciu myší. Po imunizácii sa zameriavam na fúziu buniek sp-2 a splenocytov, ktoré bolo najskôr treba odobrať z imunizovanej myši a prečistiť. Po samotnej fúzii zmieňujem selekciu hybridomovna selekčnom média HAT a následne ich detekciu najskôr pomocou metódy ELISA a neskôr pomocou metódy Western blot. Vzniknuté hybridomy s pozitívnou odozvou pri metóde ELISA boli zamrazené na ďalšie testovanie na Výskumnom ústave veterinárneho lekárstva v Brne, kde bola spravená celá praktická časť diplomovej práce. Tieto zamrazené hybridomy budú v ďalšom výskume testované imunoprecipitáciou, ktorou je táto diplomová práca zakončená.The aim of this master‘s thesis is to prepare a monoclonal antibody against cyclin-dependent kinase 13 (CDK13). The theoretical part focuses on antigen-antibody binding, which is essential for the use of monoclonal antibodies in the determination of CDK13 as well as the transcription that this kinase affects. This section is also devoted to Western blot and ELISA methods for detection of newly generated antibodies. Furthermore, the antibodies and the antigen definition are stated, which are later on discussed. The practical part is devoted to the preparation of antigen - its isolation and purification on a peristaltic pump. It also addresses immunization, its course, and the amount of antigen used to immunize mice. After immunization, the work focuses on fusion of sp-2 cells and splenocytes, which were first removed from the immunized mouse and purified. After the fusion alone, selection of hybridomas on HAT selection medium is mentioned, followed by detection first by ELISA and later by Western blotting. The resulting hybridomas with positive ELISA response are frozen for further testing at the Veterinary Research Institute in Brno, where the entire practical part of this thesis was carried out. These frozen hybridomas are further tested by immunoprecipitation to conclude this thesis.