Utilization of spectroscopy in study on stress-resistance of bacteria on the sigle-cell level

Táto diplomová práca sa zaoberá možnosťami analýzy stresovej odolnosti bakteriálnych buniek Cupriavidus necator H16 a PHB-4 pomocou spektroskopických metód a otestovaním vhodnosti akridinovej oranži ako viabilitného farbiva. Na základe literárnej rešerše boli navrhnuté vhodné analytické metódy, konkrétne prietokový cytometer a fluorescenčný mikroskop. Prvá časť experimentálnej práce bola zameraná na fluorescenčný mikroskop, ktorým bol potvrdený základný charakter akridinovej oranži. Na sledovanie viability boli vybrané tri stresové faktory, 50% a 70% etanol a kyslé pH (pH = 1). Baktérie po expozícii etanolom fluoreskovali zelenou farbou a vedľa buniek sa nachádzali červené škvrny, čo naznačuje ich stratu integrity. V kyslom prostredí baktérie fluoreskovali červene, pretože došlo k čiastočnému porušeniu DNA. Výsledky boli overené kombináciou propídium jodidu so SYTO9 a pri tejto metóde sa osvedčila vhodnosť akridinovej oranži. Obrazové záznamy boli spracované pomocou obrazovej analýzy. V druhej časti bola akridinová oranž použitá pri sledovaní fluorescencie pomocou prietokového cytometra. Výsledkom merania bola fluorescencia vyjadrená vo forme histogramov pre jednotlivé kanály, kde fluorescencia bola charakterizovaná mediánom a priemernou intenzitou. Porovnaním použitých metód sa akridinová oranž javí ako vhodnejšie fluorescnečné farbivo pre mikroskop ako pre prietokový cytometer, v ktorom bolo zložitejšie získať informácie o životaschopnosti buniek. V poslednej časti experimentálne práce boli skúmané zaujímavé fotofyzikálne vlastnosti akridinovej oranži.This diploma thesis deals with the possibilities of stress resistance analysis of the Cupriavidus necator H16 and PHB-4 bacterial cells by spectroscopic methods and by testing the suitability of acridine orange as a viable dye. Based on research in literature, suitable analytical methods have been proposed, namely flow cytometer and fluorescence microscope. The first part of the experimental work was focused on the fluorescence microscope, which confirmed the basic character of acridine orange. Three stress factors, 50% and 70% ethanol, and acidic pH (pH = 1) were selected for viability monitoring. The bacteria fluoresced with green color after exposure to ethanol and red spots were found next to the cells, indicating their loss of integrity. In an acidic environment, the bacteria fluoresced red because of a partial DNA breakdown. The results were verified by the combination of propidium iodide with SYTO9 and the acridine orange suitability proved to be useful in this method. Image records were processed using image analysis. In the second part, acridine orange was used to monitor fluorescence using a flow cytometer. The result of the measurement was fluorescence expressed as histograms for individual channels, where fluorescence was characterized by median and mean intensity. By comparing the methods used, the acridine orange appears to be a more suitable fluorescent dye for the microscope than for a flow cytometer in which it was more difficult to obtain cell viability information. In the last part of the experimental work interesting photophysical properties of acridine orange were investigated.