Développement d’un modèle murin syngénique et immun de leucémie aiguë myéloïde et de maladie résiduelle mesurable surexprimant ou non le gène Wilms Tumor 1

Acute myeloid leukemia (AML) is a genetic disorder leading to a blockade of differentiation and a clonal expansion of hematopoietic progenitors or precursors (called blasts) which accumulate in the bone marrow and then invade the blood stream. Conventional treatment relies on the use of chemotherapy agents (cytarabine in combination with an anthracycline) to eliminate leukemia cells and achieve complete remission (defined as normal bone marrow morphology with less than 5% blasts). This complete remission is achieved in a majority of patients but more than 50% of them will relapse several months after the treatment. These relapses indicate the presence of residual leukemic cells after treatment, known as measurable residual disease (MRD). It has been highlighted by the development of efficient and sensitive molecular biology technologies such as multi-parameter flow cytometry and real-time PCR allowing the detection of AML-associated expression patterns and genetic abnormalities. Several mechanisms have been described that can explain the presence of this MRD. It may be caused by the resistance to treatment of certain leukemic sub-clones (resistance-conferring mutations or quiescent phenotype) or the presence of leukemic stem cells. Finally, the immune system could also induce the quiescence of certain leukemic cells rendering them resistant to conventional chemotherapies, or control their growth leading to a state of equilibrium between their proliferation and lysis. Several AML mouse models allow the study of leukemogenesis and the testing of new therapeutic agents for leukemic cells eradication. However, they are mostly based on the transfer of human leukemic cells in immune-deficient mice and do not provide information about the role of the immune system in the leukemic cell survival, sub-clonal expansion or persistence. Moreover, there is still no available leukemia MRD mouse model allowing the study of leukemic cell persistence after chemotherapy treatment. According to these findings, the aim of this thesis was to develop a syngeneic and immune-competent mouse model of leukemia MRD overexpressing or not the Wilms' Tumor 1 (WT1) gene. The WT1 protein is described as an antigen associated with AML and is targeted by specific lymphocyte cellular and humoral responses in AML-affected patients. Creating a syngeneic and immune-competent leukemia MRD mouse model overexpressing or not this antigen will allow determining the role of this specific immune response in the cancer cell persistence. To set up this model, we first phenotyped and genotyped sub-clones isolated from the murine C1498 leukemic cell line able to induce a myelo-monocytic AML in immune-competent C57BL/6J mice. In a second step, certain sub-clones were selected for their sensitivity to cytarabine treatment and transfected to stably express the fluorescent ZsGreen protein with or without the WT1 antigen. Lastly, the MRD mouse model was obtained after modulation of various parameters such as the amount of leukemic cells administered, the kinetics and injection doses of chemotherapy. The leukemia MRD was monitored by flow cytometry (expression of the ZsGreen protein) and by real-time PCR (expression of the ZsGreen and/or Wt1 genes) in the peripheral blood and the bone marrow of treated and surviving mice. Thus, we generated a syngeneic and immune-competent leukemia MRD mouse model useful to study the immune mechanisms involved in the persistence of leukemic cell after treatment and to test new (immune)-therapeutic strategies targeting these residual cells.Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont des hémopathies malignes hétérogènes déclenchées, dans la plupart des cas, par des anomalies génétiques (mutations, translocations ou inversions). Elles se caractérisent par un blocage de la différenciation de certains progéniteurs ou précurseurs hématopoïétiques (blastes) et leur prolifération clonale incontrôlée provoquant leur accumulation dans la moelle osseuse. Le traitement actuel de ces patients repose essentiellement sur l’utilisation d’agents de chimiothérapie (cytarabine associée à une anthracycline) permettant d’éliminer les cellules leucémiques et d’obtenir une rémission complète (RC) (définie morphologiquement comme une moelle osseuse normale avec moins de 5% de blastes). Cette RC est obtenue chez une majorité des patients mais plus d’un patient sur deux va rechuter quelques mois après l’arrêt du traitement. Ces rechutes attestent de la persistance de cellules leucémiques résiduelles après le traitement, que l’on appelle maladie résiduelle mesurable (MRD). Celle-ci a été mise en évidence grâce au développement de technologies performantes et sensibles tels que la cytométrie en flux multi-paramétrique et la PCR en temps réel (qPCR) permettant ainsi la détection de profils d’expression ou d’anomalies génétiques associés aux LAM. A ce jour, plusieurs mécanismes ont été décrits pour expliquer la présence de cette MRD. Celle-ci peut être causée par une résistance au traitement de certains sous-clones leucémiques (anomalies génétiques intrinsèques leur conférant une résistance ou un phénotype quiescent) ou par la présence de cellules souches leucémiques (naturellement quiescentes). Le système immunitaire pourrait également jouer un rôle en induisant la quiescence de certaines cellules les rendant résistantes aux chimiothérapies conventionnelles, ou en contrôlant leur croissance tumorale par l’établissement d’un état d’équilibre entre leur prolifération et leur lyse. Les modèles murins de LAM actuellement utilisés permettent d’étudier la leucémogenèse et l’efficacité thérapeutique de certains composés mais font abstraction du rôle de la réponse immunitaire dans ces processus du fait de leur immunodéficience. De plus, aucun modèle murin de MRD leucémique n’existe pour étudier les causes de la persistance cancéreuse après traitement par chimiothérapie. Ainsi, le but de cette thèse a été de développer un modèle murin syngénique et immunocompétent de MRD leucémique sur-exprimant ou non le gène Wilms’ Tumor 1 (WT1). WT1 est un des rares antigènes décrits dans les LAM et une réponse lymphocytaire cellulaire et humorale dirigée contre cette protéine a été décrite chez ces patients. La création de ce modèle sur-exprimant ou non WT1 permettra ainsi d’étudier le rôle de la réponse immunitaire spécifique de celui-ci dans la persistance leucémique. Pour développer ce modèle nous avons, dans un premier temps, caractérisé phénotypiquement et génotypiquement des sous-clones isolés de la lignée leucémique C1498 capable d’induire une LAM de type myélo-monocytaire chez des souris immunocompétentes C57BL/6J. Dans un deuxième temps, certains sous-clones ont été sélectionnés pour leur sensibilité à la cytarabine et transfectés de manière à exprimer stablement une protéine fluorescente (ZsGreen) en association ou non avec la protéine WT1. Enfin, ce modèle de MRD leucémique a été obtenu en modulant la quantité de cellules leucémiques injectée ainsi que la cinétique et la dose d’injection de la cytarabine. La MRD a été suivie par cytométrie en flux (expression ZsGreen) et par qPCR (expression ZsGreen et/ou de Wt1) dans le sang et la moelle osseuse des souris survivantes grâce au traitement [...]