Preclinical development of adoptive cellular immunotherapeutic protocols for the outcome improvement of onco-hematologic patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation

Il trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) resta ad oggi l’unico trattamento curativo delle malattie onco-ematologiche, nonostante i notevoli miglioramenti ottenuti usando la chemioterapia e più recentemente le terapie verso un bersaglio molecolare specifico. In un contesto trapiantologico allogenico è fondamentale riuscire a trovare un bilanciamento tra la potenziale induzione della graft-versus-host disease (GVHD) e gli aspetti benefici della disparità tissutale tra donatore e ricevente, la cosiddetta graft-versus-leukemia (GVL). Sfortunatamente il trapianto risulta efficace in misura molto variabile (40-80% dei casi), per refrattarietà ai farmaci o ricaduta. Quest’ultima rimane la maggiore causa di fallimento dopo HSCT per i pazienti ad alto rischio di malattie ematologiche. Inoltre, sono frequenti le complicazioni infettive, dovuta alla pesante immunosoppressione, assolutamente necessaria per la prevenzione di GVHD severa. Gli approcci di immunoterapia cellulare sono uno strumento promettente per i pazienti che ricevono un HSCT, mantenendo l’effetto benefico della GVL, componente che maggiormente influenza l’efficacia del trapianto allogenico per i tumori del sangue, dovuta principalmente al riconoscimento immunologico ed all’eliminazione delle cellule leucemiche residue da parte dei linfociti T del donatore. Le azioni per aumentare l’effetto GVL nel prevenire la ricaduta in soggetti con leucemie ad alto rischio, pur minimizzando la tossicità, si sono focalizzati sull’uso di immunoterapia antileucemica mirata. Queste strategie includono metodi per incrementare l’effetto GVL con infusione di linfociti da donatore (DLI), che tuttavia presenta limitazioni dovute al fatto che la strategia si dimostra realmente efficace solo in pazienti con CML e all’alto rischio di GVHD. Recenti studi clinici con cellule cytokine-induced killer (CIK) esplorano il duplice potenziale antitumorale ed alloreattivo di questa eterogenea popolazione di linfociti T policlonali, che potrebbe influenzare favorevolmente il bilancio tra GVL e GVHD. Oltre agli aspetti descritti, legati al rigetto ed alla ricaduta, il contesto trapiantologico allogenico porta spesso a complicazioni infettive, per la prolungata e severa immunodeficienza a cui è sottoposto il paziente: nonostante il trattamento antivirale profilattico e preventivo, le riattivazioni virali rappresentano circa il 30% delle cause di morte da infezione dopo HSCT. L’infezione da citomegalovirus umano (CMV) è una di queste complicazioni fatali. Attualmente sono in fase di studio in un setting clinico, strategie di selezione rapida per isolare linfociti T CMV-specifici (CMV-T) derivanti da donatore e i recenti miglioramenti nella produzione di terapia cellulare-T per le infezioni virali, hanno notevolmente semplificato il loro ottenimento. Diversi approcci di terapia cellulare adottiva sono attualmente oggetto di studi clinici nella loro fase conclusiva, prospettando la possibilità che il trasferimento adottivo di CMV-T possa diventare uno standard di cura dopo HSCT. Nonostante queste ottimizzazioni, devono essere sviluppate nuove strategie per superare l’impossibilità di produrre linfociti T contro CMV da donatori CMV-sieronegativi. Questi approcci si basano su: vaccinazione del ricevente con cellule dendritiche (DCs), trasferimento adottivo di linfociti T da donatore da terza parte ed espansione di cellule Vδ2neg γδT reattive verso CMV. Tra queste, la vaccinazione con DC presentanti l’antigene di interesse rappresenta un approccio immunostimolatorio potente e versatile ed alcuni risultati clinici sono già disponibili. Nel presente studio sono stati sviluppati protocolli di immunoterapia cellulare adottiva per la produzione di prodotti medicinali di terapia avanzata (ATMPs) e trattamenti cellulari di manipolazione minima per migliorare l’esito in pazienti sottoposti a trapianto allogenico. I risultati ottenuti potranno essere utilizzati per la compilazione del Investigational Medicinal Product Dossier (IMPD), richiesto da parte delle Autorità Competenti per l’approvazione di trial clinici con farmaci sperimentali in Unione Europea. In particolare, abbiamo prodotto procedure operative standard (SOPs) per la caratterizzazione e la produzione di cellule CIK, per il possibile controllo di GVHD e GVL nei pazienti a rischio dopo HSCT, in condizioni GMP-like, predisponendo la rapida traslazione clinica di questi protocolli. Vengono riportati i dati preliminari relativi all’isolamento, produzione e caratterizzazione di linfociti T specifici per CMV ed alla generazione clinical-grade di cellule dendritiche. Abbiamo messo a punto tecniche per l’isolamento e la caratterizzazione delle cellule immunitarie prima dell’infusione. Gli scopi principali di questi studi pre-clinici sono la determinazione della sicurezza ed efficacia del prodotto finito, per la traslazione clinica nel controllo della riattivazione di CMV. Questa parte è stata ampiamente sviluppata in collaborazione con il Dipartimento di Medicina Interna II dell’Ospedale Universitario di Würzburg (Germania), il primo in Europa ad usare approcci di terapia cellulare per il trattamento delle infezioni dopo HSCT. Il progetto è stato svolto presso il Laboratorio di Terapie Cellulari Avanzate (LTCA), parte del Dipartimento di Ematologia e Terapie Cellulari dell’Ospedale S. Bortolo di Vicenza, con il supporto della Fondazione Progetto Ematologia. LTCA conduce la sua attività in collaborazione con il Centro Trapianti di Midollo Osseo, accreditato dal JACIE (Joint Accreditation Committee ISCT-EBMT) per il trapianto allogenico di midollo osseo, che rappresenta uno dei principali centri di Ematologia del Nord Italia.Although important advances have been made in the treatment of hematological malignancies using chemotherapy, and more recently with targeted therapies, curative treatments often require allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). One of the major challenges in HSCT is to find a balance between the harmful induction of graft-versus-host disease (GVHD) and the beneficial aspects of tissue disparity, namely graft-versus-leukemia (GVL). Unfortunately, even this intensive treatment fails to prevent relapse in 10%-60% of cases, depending on whether the disease was successfully treated early or was relapsing or refractory at the time of transplantation. Relapse remains the major cause of treatment failure after HSCT for patients with high-risk hematological malignancies. In addition, strong immunosuppression absolutely essential for the prevention of severe GVHD, leads to infectious complications. To overcome these issues, cellular based-immunotherapeutic approaches represent a promising tool for the graft recipient patients, while maintaining the GVL effect. The so-called GVL effect is a major component of the effectiveness of HSCT for hematological malignancies and is due primarily to immunologic recognition and elimination of recipient leukemia cells by donor T cells: improvements in exploiting the GVL effect to prevent relapse in high-risk leukemias while minimizing toxicity have focused on the use of targeted antileukemic immunotherapy. These strategies include methods to boost the GVL effect with donor lymphocyte infusion (DLI) but the limited spectrum of activity and high risk of GVHD remain major limitations of this approach. Recent clinical studies with cytokine-induced killer (CIK) cells explore the antitumor and alloreactive potentials of this heterogeneous population of polyclonal T lymphocytes, that might favourably affect the balance between GVL and GVHD. After HSCT, a prolonged and severe immune deficiency often leads to infectious complications: despite prophylactic or pre-emptive antiviral treatment viral reactivations consist in about 30% of death after HSCT. Human cytomegalovirus (CMV) infection is one of such life-threatening complication. Rapid selection strategies to isolate donor-derived CMV-specific T cells (CMV-T) are currently being tested in the clinical setting and recent advances in the manufacturing of T-cell therapy for viral infections have greatly simplified the production. Several approaches of adoptive cellular therapies are now being evaluated in late-phase or licensing studies, raising the prospect that adoptive transfer of CMV-T may become a standard of care after HSCT. To overcome the impossibility to produce T cells against CMV from CMV-seronegative donors, new strategies able to induce pathogen-specific responses should be developed. These approaches relies on recipient dendritic cells (DCs) vaccination, third-party adoptive T-cell transfer and on CMV-reactive Vδ2neg γδT cells expansion. Among these, vaccination with antigen-loaded DCs has been shown to be a potent and versatile immunostimulatory approach and some clinical trials results are already available. This study is aimed at the development of adoptive cellular immunotherapeutic protocols for the production of Advanced Therapy Medicinal Products (ATMPs) for the outcome improvement of patients after HSCT. In particular, we provide standard operating procedures (SOPs) to obtain fully effective and characterized CIK cells ready to use in a clinical setting under good manufacturing practice (GMP)-like conditions. Indeed, the established protocol can be used to compile the Investigational Medicinal Product Dossier (IMPD), the basis for the approval of a clinical trial with investigational new drugs by the competent authorities in the European Union. We report preliminary data on manufacturing of CMV-T and CMV-loaded DCs: we set up experimental procedures to isolate, expand and characterize the immune cells prior to infusion. The main goals of these pre-clinical studies are to determine the safety and potency profiles of the cellular product for its translation to the clinic, in the control of CMV reactivation. This part of the project was largely developed in collaboration with the Department of Internal Medicine II of the University Hospital of Würzburg (Germany), the first in Europe to use cellular therapy for treatment of infections after HSCT. The overall project was lead by the Advanced Cellular Therapy Laboratory (LTCA), part of the Cell Therapy and Hematology Department of the S. Bortolo Hospital, in collaboration with the Bone Marrow Transplant Center and with the Hematology Project Foundation