Emergence of resistance mechanisms to last-resource antibiotics in multi-drug resistant (MDR) pathogens

Il trattamento antibiotico delle infezioni causate da patogeni multi-resistenti (MDR) è attualmente un argomento fondamentale nella pratica clinica. I batteri multi-resistenti ospitano vari geni che conferiscono resistenza a diverse classi di antibiotici, lasciando a disposizione poche opzioni terapeutiche. Nel caso dei batteri MDR Gram-positivi (stafilococchi meticillino resistenti, enterococchi vancomicina resistenti) il linezolid rappresenta l’ultima risorsa. Questo composto inibisce la sintesi proteica batterica legandosi al dominio V della regione dell’rRNA 23S della subunità 50S inibendo così, in ultima analisi, la formazione del ribosoma 70S. I tassi di resistenza al linezolid sono ancora bassi e nella maggior parte dei casi è mediata da mutazioni in diverse posizioni nel sito di legame dell’antibiotico. Nel caso dei patogeni MDR Gram-negativi, la somministrazione di carbapenemici è diventata più frequente grazie all’aumento dell’isolamento di ceppi batterici produttori di beta-lattamasi a spettro esteso (ESBL). Attualmente la resistenza ai carbapenemici costituisce un problema sanitario globale. Varie carbapenemasi che idrolizzano i beta-lattamici, compresi i carbapenemci, conferiscono spesso resistenza a questi antibiotici in vari isolati di enterobatteri. Lo scopo di questa tesi è stato quello di caratterizzare la resistenza a livello genetico degli stafilococchi resistenti al linezolid tra i Gram-positivi e quello di definire i geni e il profilo plasmidico dei ceppi di enterobatteri resistenti ai carbapenemici tra i Gram-negativi. Nella parte di progetto riguardante i Gram-positivi, sono stati analizzati 11 ceppi di Staphylococcus haemolyticus resistenti al linezolid isolati nell’Ospedale Universitario di Verona e 14 stafilococchi coagulasi negativi (CoNS) (10 S. epidermidis, 2 S. capitis e 2 S. hominis ) resistenti al linezolid isolati nell’Ospedale di Vicenza. Nei ceppi di stafilococco coagulasi-negativi resistenti al linezolid sia di Verona che di Vicenza sono state trovate mutazioni puntiformi nel dominio V dell’rRNA 23S. I ceppi di S. haemolyticus resistenti al linezolid di Verona presentavano tutti la mutazione G2576T, mentre nella collezione di Vicenza sono state riscontrate le mutazioni G2576T o G2447T. Quest’ultima mutazione era associata ai ceppi di S. epidermidis, mentre la mutazione classica G2576T è stata correlata, oltre che con S. epidrmidis, anche con gli altri stafilococchi coagulasi negativi, come S. capitis e S. hominis. L’effetto fenotipico di queste mutazioni consisteva in un aumento del valore di MIC del linezolid che raggiungeva i 16-32 mg/L, un livello di resistenza elevato che, almeno nel caso della mutazione G2576T, viene spiegato da un documentato cambiamento di nucleotide in ognuna delle copie dell’rRNA 23S. Per quanto riguarda i ceppi isolati a Vicenza inoltre abbiamo riportato per la prima volta il fatto che due diverse specie di stafilococchi coagulasi negativi (S. epidermidis - S. capitis and S. epidermidis - S. hominis) con mutazioni differenti nel gene dell’rRNA 23S fossero isolate contemporaneamente nello stesso paziente. Nella parte di progetto riguardante i Gram-negativi, sono stati presi in considerazione 10 ceppi di Enterobacteriaceae resistenti ai carbapenemici (8 Klebsiella pneumoniae, 1 Escherichia coli e 1 Enterobacter aerogenes) isolate nell’Ospedale Universitario di Verona e negli ospedali di Negrar e Treviso. Inoltre sono stati considerati 5 ceppi di enterobatteri resistenti ai carbapenemici provenienti dalla Croazia (4 K. pneumoniae and 1 Citrobacter koseri). Fra i 15 ceppi di enterobatteri resistenti ai carbapenemici, 9 ceppi presentavano il gene blaKPC-3, 5 ceppi blaNDM-1 e un ceppo di K. pneumoniae ospitava il gene blaOXA-48. Gli isolati clinici presentavano profili plasmidici diversi e, oltre alle carbapenemasi, atri vari determinanti di resistenza agli antibiotici (altre beta-lattamasi e determinanti di resistenza ai chinoloni mediati da plasmide, come CTX-M-15, TEM-1, SHV-1, SHV-11, SHV-12, OXA-1, CMY-4, AAC(6’)-Ib-cr and QnrB1). I geni che codificavano per le carbapenemasi erano localizzati su plasmidi coniugativi e precisamente: blaKPC-3 sul plasmide IncFIIk, blaNDM-1 su IncR e A/C e blaOXA-48 su L/M. Il plasmide IncFIIk che portava KPC-3 co-esprimeva anche gli enzimi TEM-1 e OXA-9. Il plasmide IncR, oltre a blaNDM-1, portava anche i geni per TEM-1, OXA-1, CTX-M-15, SHV-12, AAC(6’)-Ib-cr, mentre il plasmide A/C ospitava anche i geni SHV-1, CMY-4 and AAC(6’)-Ib-cr. Mentre il plasmide L/M che ospitava OXA-48 non presentava altri determinanti di resistenza anche se questi erano presenti nell’isolato clinico di K. pneumoniae. La tipizzazione molecolare mediante multi-locus sequence typing (MLST) degli isolati che esprimevano KPC-3 ha messo in evidenza che 2 ceppi di K. pneumoniae appartenevano al clone ST258 ampiamente diffuso e 5 al ST512 (appartenente allo stesso complesso clonale) mentre E. coli al ST43. Nella collezione di ceppi che esprimevano NDM-1, 3 K. pneumoniae erano membri del ST15 e una del ST16. Il ceppo di K. pneumoniae produttore di OXA-48 apparteneva al clone internazionale ST101. E’ importante sottolineare che abbiamo confermato che la trasmissione del gene blaKPC-3 da un ceppo di K. pneumoniae ST512 al ceppo di E. coli ST43 è avvenuta in vivo in un paziente. La rilevanza epidemiologica delle nostre ricerche sta nel fatto che oltre al clone internazionale ST258 sta diffondendo anche il clone ST512 tra i ceppi di K. pneumoniae. Inoltre tra i ceppi di Enterobacteriaceae produttori di NDM-1 risulta di particolare importanza il fatto che questo gene sia ospitato su un plasmide IncR, non ancora riportato in letteratura. Questi risultati confermano che i ceppi di Enterobacteriaceae possono acquisire diversi determinanti di resistenza agli antibiotici, risultando in fenotipi multi-resistenti che lasciano poche se non nulle opzioni terapeutiche. Al fine di seguire la diffusione dei diversi geni che codificano per carbapenemasi e i tipi di plasmidi su cui queste vengono ospitati è necessario, oltre al test fenotipico di sensibilità agli antibiotici, anche una analisi genetica molecolare. La MLST dovrebbe essere eseguita per scopi epidemiologici, in modo da determinare i cloni batterici e la loro diffusione anche tra paesi diversi.Nowadays, the antibiotic treatment of infections caused by multi-drug resistant (MDR) pathogens is a cardinal topic. The MDR bacterial isolates harbour multiple antibiotic resistant genes conferring resistance to antibiotics of different classes, leaving a few options for therapy. In the case of MDR Gram-positive bacteria (methicillin-resistant staphylococci, vancomycin-resistant enterococci) linezolid is a last-resource antibiotic. Linezolid inhibits bacterial protein synthesis by binding to the domain V region of 23S rRNA and the effect of binding to 50S is inhibition of 70S formation. Linezolid resistance is low, and most frequently mediated by mutations at different positions at the binding site of the antibiotic. In the case of Gram-negative pathogens, the carbapenems became frequently administered due to increased frequency of bacterial strains producing extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs). Currently, resistance to carbepenems is a global health-care problem. In Enterobacteriaceae strains, variety of carbapenemases hydrolysing beta-lactam antibiotic confer resistance to carbapenems most frequently. The goal of the thesis was to characterize the molecular genetic background of Gram-positive, linezolid-resistant staphylococci and to define antibiotic resistant genes and plasmid profile of Gram-negative, carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains. In the Gram-positive MDR project, 11 linezolid-resistant Staphylococcus haemolyticus from the University Hospital of Verona and 14 coagulase-negative staphylococci (CoNS) (10 S. epidermidis, 2 S. capitis and 2 S. hominis) from Vicenza Hospital were investigated. Investigating linezolid-resistant CoNS from Verona and Vicenza, point mutations in domain V of the 23S rRNA gene were revealed. The linezolid-resistant S. haemolyticus strains from Verona uniformly harboured alteration at position G2576T, while the collection of CoNS strains from Vicenza carried either G2576T or G2447T mutations. The alteration at G2447T was associated with S. epidermidis, while the classical G2576T mutation was found to be related to CoNS other than S. epidermidis, namely S. capitis and S. hominis. The phenotypic effect of these mutations was increased linezolid MICs of 16 – 32 mg/L, a high level of resistance that, at least for mutation G2576T, was explained by the documented nucleotide change in every copy of the 23S rRNA. In the staphylococci collection from Vicenza, to the best of our knowledge, this is the first report in which 2-2 different CoNS (S. epidermidis - S. capitis and S. epidermidis - S. hominis) species with different mutations in the 23S rRNA gene were isolated from the same patients. In the Gram-negative MDR study, 10 carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains (8 Klebsiella pneumoniae, 1 Escherichia coli and 1 Enterobacter aerogenes) from University Hospital of Verona, Negrar Hospital and Treviso Hospital were included. From Croatia 5 carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains (4 K. pneumoniae and 1 Citrobacter koseri) were included. Among the 15 carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains, 9 strains carried blaKPC-3, 5 strains were positive for blaNDM-1 and 1 K. pneumoniae harboured blaOXA-48 carbapenemase gene. The clinical isolates hosted different plasmid profiles and several additional antibiotic resistant determinants (beta-lactamases and plasmid-mediated quionolone resistant determinants, namely, CTX-M-15, TEM-1, SHV-1, SHV-11, SHV-12, OXA-1, CMY-4, AAC(6’)-Ib-cr and QnrB1). These carbapenemase genes were localised on conjugative plasmids, namely, blaKPC-3 on IncFIIk, blaNDM-1 on IncR and on A/C and blaOXA-48 on L/M. The KPC-3 positive IncFIIk plasmid co-expressed of TEM-1 and OXA-9 enzymes. Beside blaNDM-1, the IncR plasmid co-carried the genes of TEM-1, OXA-1, CTX-M-15, SHV-12, AAC(6’)-Ib-cr, while A/C plasmid co-harboured genes of SHV-1, CMY-4 and AAC(6’)-Ib-cr. Although the K. pneumoniae clinical isolate expressing OXA-48 produced many associated antibiotic resistant determinants, the L/M plasmid responsible for the carbapenemase carried only blaOXA-48. Multilocus sequence typing (MLST) revealed that, among the KPC-3 expressing strains, 2 K. pneumoniae belonged to the widespread ST258 clone and 5 strains to ST512 and E. coli was ST43. In the NDM-1 positive collection, 3 K. pneumoniae strains were member of ST15 and one K. pneumoniae was ST16. The OXA-48 producing K. pneumoniae belonged to ST101, international clone. Noteworthy, that the transmission of blaKPC-3 gene between K. pneumoniae strain ST512 and E. coli ST43 in a single patient was confirmed. The epidemiological relevance of our findings is that beside the ST258 international clone, the ST512 clone is also spreading among K. pneumoniae strains. Among NDM-1 producing Enterobacteriaceae, the detection of IncR plasmid is of particular relevance, to the best of our knowledge so far not reported in the literature. These results confirmed that Enterobacteriaceae strains can acquire different antibiotic resistance determinants, thus resulting in multi-drug resistant phenotypes leaving few therapeutic options. The phenotypic antimicrobial susceptibility testing should be confirmed by molecular genetic analysis to follow the spread of the different carbapenemase genes and the responsible plasmid types. MLST is recommended for epidemiological purposes, so as to determine the bacterial clones and their spreading even between different countries