A study on the yeast and mould biota associated with the production of Italian wines from post-harvest dried grapes

I vini Passiti ottenuti da uve che hanno subito un processo di appassimento sono vini rinomati e apprezzati dai consumatori principalmente per le complesse note sensoriali dovute al particolare processo di vinificazione. La fase di sovra-maturazione è fortemente influenzata dai microrganismi presenti sull’acino e in particolare da Botrytis cinerea in forma nobile. La presenza di questa muffa favorisce la disidratazione dell’acino e modifica la composizione del mosto che, infatti, presenta un elevato tenore zuccherino e contiene metaboliti secondari prodotti dalla muffa che possono inibire il processo fermentativo. Date queste condizioni stressanti per i lieviti, la fermentazione spontanea è spesso accompagnata da elevata produzione di acidità volatile oltre che a blocchi o arresti fermentativi. Di conseguenza, per controllare meglio questa fase critica una strategia biotecnologica innovativa potrebbe essere l'utilizzo di colture starter di lieviti autoctoni ben adattati a queste condizioni. L’obiettivo di questo progetto di ricerca è stato - quindi - quello di acquisire conoscenze sulla diversità microbica associata alla produzione di alcuni vini italiani (quali Amarone, Vin Santo di Gambellara e Vino Santo Trentino) e di ottimizzare il processo di vinificazione attraverso l'uso di ceppi selezionati di B. cinerea e di lieviti autoctoni durante il processo di appassimento e la fermentazione. In questo contesto, è stata allestita un’ampia collezione di muffe, tra cui B. cinerea, isolate da uve appassite, e una collezione di lieviti costituita da lieviti Saccharomyces e non-Saccharomyces isolati durante il processo di affinamento in caratelli e durante la fase di fermentazione di mosto Garganega utilizzato per la produzione del Vin Santo di Gambellara. Per quento riguarda l’appassimento, a processo concluso, il vino ottenuto da queste uve è stato analizzato gas-cromatograficamente. I vini ottenuti hanno indicato differenze importanti tra le tesi inoculate e l'uva di controllo (non inoculata) per diversi composti volatili liberi. Come previsto, il livello più alto di 1-otten-3-olo (sapore di muffa) è stato trovato per i vini ottenuti da uve inoculato. Questi dati suggeriscono che l'inoculo di ceppi selezionati di B. cinerea su uva può influenzare le caratteristiche organolettiche del mosto/vino, consentendo così una diversificazione del prodotto finale. Per quanto riguarda le prove di fermentazione guidata, l'analisi dei vini ha rivelato che la fermentazione spontanea produce un elevato livello di acetato di etile rispetto alle tesi inoculate con i ceppi selezionati di S. cerevisiae. Pertanto, l'uso di ceppi autoctoni può limitare la produzione di acidità volatile. Inoltre, l'analisi dei composti volatile ha evidenziato come tutti i vini ottenuti dai mosti fermentati con i ceppi selezionati presentano aromi associati a frutta bianca, alla rosa mandorla, fragola e caramello enfatizzando le proprietà aromatiche e il sapore del Vin Santo di Gambellara. L'analisi sensoriale ha ulteriormente confermato le differenze tra i diversi vini suggerendo quindi che l'uso di ceppi selezionati può migliorare il processo di fermentazione di vini passiti. In conclusione, questo progetto di ricerca ha evidenziato che l'uso di ceppi indigeni opportunamente selezionati (muffe e lieviti) è in grado di migliorare l’intero processo di produzione dei vini passiti minimizzando i rischi di blocchi, arresti fermentativi e produzione di acidità volatile, nonchè di influenzare positivamente la qualità sensoriale del prodotto finito. Unitamente all’uso di culture starter, l'uso di metodi alternativi validi in sostituzione all’anidride solforosa (SO2) potrebbe migliorare l'impatto commerciale dei vini privi di conservanti chimici. In questo modo può essere soddisfatta la sempre più elevata domanda da parte dei consumatori di vini sicuri, salubri e organoletticamente distintivi.The wines obtained from post-harvest dried grapes are renowned wines, appreciated by consumers because of their complex sensorial notes due to the special vinification process, which involves the withering of grapes. The over-ripening phase is strongly influenced by the heterogeneous fungal biota present on the grape berry skin, and particularly by Botrytis cinerea. The development of the noble rot in berries affects the composition of the grape juice that presents high sugar content and inhibitory substances, as well. Therefore, grape juice fermentation proceeds hardly and is often accompanied by high production of volatile acidity. To better control the critical steps of Passito winemaking process, i.e. withering and fermentation, the use of suitable selected starter cultures could be applied as an innovative biotechnological strategy. Aims of this project were to increase knowledge about the diversity and evolution of indigenous eukaryotic microbiota associated with the production of some selected Italian wines (i.e. Amarone, Vin Santo di Gambellara, and Vino Santo Trentino) and to optimize the whole winemaking process through the use of selected indigenous strains of B. cinerea and yeasts. To these purposes, a large collection of moulds including B. cinerea was assembled; while a collection of yeasts (Saccharomyces and non-Saccharomyces) from wine aging in barrels and from the fermentation process of Garganega grape juice used for the production of Vin Santo di Gambellara was constituted. The isolates were identified using phenotypic and molecular methods, and then the collections were dereplicated by RAPD-PCR, PCR-RFLP, TEs, and microsatellite analysis. These techniques allowed the detection of a high genetic biodiversity among the B. cinerea and yeast isolates. The presence of distinctive strains could differentiate the withering of the studied grapes and the fermentation process, consequently selected strains of B. cinerea and yeasts were further characterized for several oenological properties (i.e. laccase activity and fungicide resistance for B. cinerea; resistance to stressful conditions and production of secondary metabolites for yeasts). In this way, strains of B. cinerea, S. cerevisiae and Zygosaccharomyces spp. were selected and tested in pilot-scale induction and fermentation trials, respectively. Considering the withering phase, at the end of the process the grapes were crushed and the grape juices were fermented. The gas-chromatographic analysis of the obtained wines indicated important differences between the inoculated and control grapes for several free volatile compounds. As expected, higher level of 1-octen-3-ol (mould flavor) was found for the wines obtained from the inoculated grape. These data suggest that the inoculum of selected B. cinerea strains on grapes influence the organoleptic characteristics of the must/wine, thus allowing a diversification of the final product. As regard the fermentation phase, the use of indigenous S. cerevisiae and non-Saccharomyces strains improved the fermentation process of Vin Santo di Gambellara. Indeed, failure to initiate fermentation and stuck fermentation were avoided, and a lower level of ethyl acetate was produced respect to the spontaneous fermentation. All selected S. cerevisiae yeasts produced flavors associated with white fruit, rose note, almond note and strawberry and caramel fragrance that emphasized the aromatic and flavor properties of this Passito wine. In conclusion, this research project suggests that the use of selected indigenous strains (moulds and yeasts) could improve the fermentation process of Passito wines minimizing risky conditions and improving the sensory quality of the final product. In other side, the use of valid alternative methods to SO2 addiction could improve the commercial impact of the wines free of chemical preservatives. In this way the modern consumer demand for wines that are safe and characterized by particular organoleptic flavour can be satisfied