Identification of Pseudomonas aeruginosa released proteins: effects of oxygen limitation and azithromycin treatment in clinical and laboratory strains

Caratteristica della fibrosi cistica (FC) è la colonizzazione del polmone da parte di batteri, in particolare Pseudomonas aeruginosa (Pa). Essa prevede l’instaurarsi di un’interazione batterio-ospite, la quale è mediata non solo dal contatto diretto con il microorganismo, solitamente ostacolato dalla presenza di dense secrezioni e dall’insediamento di ceppi mucoidi, ma anche dal rilascio di fattori specifici. Pa cresce nelle vie respiratorie di pazienti FC in condizioni di microaerobiosi. Quando le cellule epiteliali delle vie respiratorie FC sono state trattate con surnatante batterico ottenuto in seguito alla cultura del ceppo clinico AA2, cresciuto in aerobiosi e microaerobiosi, si è osservato in entrambi le condizioni un significativo aumento di IL-8 mRNA, a differenza del surnatante del ceppo di laboratorio PAO1 che non ha indotto alcuna significativa risposta pro-infiammatoria. Allo scopo di individuare fattori proteici rilasciati da Pa aventi attività pro-infiammatoria è stata applicato un approccio proteomico innovativo (MudPIT: Multidimensional Protein Identification Technology) che ha permesso di identificare 451 e 235 proteine nel surnatante di AA2 e PAO1 rispettivamente. L’analisi proteomica ha rivelato che varie proteine sono espresse e rilasciate in modo differente a seconda del ceppo, clinico o di laboratorio, e delle condizioni di coltura, aerobiche o microaerobiche. Tra queste, di particolare interesse, vi sono undici diverse proteasi che sono state trovate nel surnatante del ceppo AA2, mentre solo quattro sono stati rilevate nel surnatante del ceppo PAO1. Ecotin, un inibitore delle proteasi, è presente in quantità notevole nel surnatante di PAO1 rispetto a quello di AA2 ottenuti entrambi in microaerobiosi. Questi risultati sono stati confermati dai saggi di Western blot e zimogramma. Il livello di espressione delle proteasi e dell’inibitore ecotin nei due ceppi correla con l’attività pro-infiammatoria osservata in vitro. Solo nel 31% dei ceppi di Pseudomonas aeruginosa isolati da pazienti FC cronicamente infetti è stata osservata una discreta attività metalloproteasica mentre è state identificata in tutti gli isolati che derivano da pazienti FC infettati sporadicamente. Questi risultati suggeriscono che la tecnologia MudPIT può essere utile per dipanare la complessità del microambiente polmonare caratterizzato da infezione e infiammazione cronici e per facilitare l'identificazione delle molecole chiave coinvolte nell’interazione tra batterio Pa e vie respiratorie. Negli ultimi anni c’è stato un crescente interesse per l'utilizzo dell’antibiotico azitromicina (AZM) per il trattamento delle patologie polmonari in pazienti affetti da fibrosi cistica. L’azitromicina agisce quale inibitore della sintesi proteica nei batteri. Nonostante Pseudomonas aeruginosa risulti essere resistente all’azione del farmaco, la somministrazione del macrolide comporta in soggetti affetti da infezione cronica un miglioramento dell’intero quadro patologico. E’ stato suggerito che la modulazione dei fattori di virulenza di Pa sia correlata agli effetti benefici riscontrati nei pazienti FC. Abbiamo testato gli effetti dell’ azitromicina in relazione all’ isolato clinico AA2, per stabilire come questo farmaco potrebbe interferire con la produzione dei fattori di virulenza batterica. Abbiamo dimostrato che l'aumento di IL-8 mRNA in cellule epiteliali CF indotto dal surnatante prodotto dalla coltura di AA2 è stato significativamente ridotto quando il ceppo clinico è stato cresciuto in presenza di AZM, suggerendo che questo macrolide riduce la patogenicità di Pa. Nel tentativo di ottenere informazioni sull'identità delle molecole rilasciato dal ceppo clinico PA prima e dopo il trattamento con AZM abbiamo applicato la tecnologia MudPIT. Abbiamo trovato 12 proteine differenzialmente espresse e rilasciate nel surnatante di AA2 cresciuto in presenza e assenza dell’antibiotico. Una delle proteine di interesse è la metalloproteasi alcalina (APR) che viene down-regolata in presenza di AZM. E’ stato anche osservato che AZM diminuisce l'attività metalloproteasica e l’espressione di APR in surnatanti di isolati clinici di individui infettati sporadicamente, mentre nessun effetto è stato osservato nei surnatanti isolati di pazienti FC cronicamente infetti. Questi risultati sono stati validati per mezzo di zimogramma e Western blot. L'analisi MudPIT delle proteine rilasciate dal ceppo clinico AA2 cresciuto in assenza e in presenza di AZM suggerisce che tale macrolide possa diminuire l'espressione e il rilascio di fattori associati alla virulenza del batterio. Gli effetti dell’ AZM, inoltre, sull'espressione e il rilascio di fattori pro-infiammatori da ceppi clinici possono contribuire a spiegare i benefici clinici associati con la terapia del macrolide.Colonization by Pseudomonas aeruginosa (Pa) is a hallmark of lung disease in cystic fibrosis (CF), where microaerobic conditions develop as a consequence of disease progression. Conditioned medium (CM) obtained from Pa clinical strain AA2, unlike the CM from laboratory strain PAO1, induces in airway epithelial cells IL-8 mRNA in both aerobic and microaerobic conditions. The effect was impaired by protease digestion. Shotgun proteomic analysis (Multidimensional protein identification technology: MudPIT) of conditioned medium of PAO1 and AA2 identified 451 and 235 individual proteins. Various proteins were found differentially regulated between strains and culture conditions. Among these eleven different proteases were found released by the AA2 strain, while fewer peptides of only four of them were detected in the PAO1 strain. Ecotin, a protease inhibitor, was found to be highly represented in PAO1 in comparison with AA2 grown in microaerobiosis. These results were confirmed by functional assay (zymography) and western blotting. The pattern of expression of several proteases and their inhibitor ecotin correlates with pro-inflammatory activity in vitro better than other candidate virulence factors. Only 31% of the Pa strains isolates from chronically infected CF patients expressed detectable metalloprotease activity while all the isolates derived from sporadically infected individuals scored positive (individual strains analyzed: 42, p