Allergia inalatoria ed alimentare al frumento: uno studio allergomico

Le proteine della farina di frumento sono considerate gli allergeni responsabili del 60-70% dei sintomi respiratori che si manifestano nella malattia professionale denominata “asma dei panificatori”; inoltre il frumento è tra i 6 principali allergeni alimentari coinvolti in reazioni di ipersensibilità IgE-specifiche. Nel caso dell’allergia alimentare al frumento le manifestazioni variano da sintomi respiratori, gastrointestinali e cutanei fino a gravi reazioni sistemiche. Nonostante questa rilevanza allergologica, a livello molecolare la conoscenza degli allergeni del frumento è piuttosto scarsa. Una conseguenza di questa limitata conoscenza è che la diagnosi di malattie, quali l’asma del panificatore, può essere una difficile impresa. Si presuppone tuttavia che sia gli epitopi sequenziali che quelli conformazionali possano essere responsabili di queste reazioni allergiche. Lo Skin prick test (SPT) gioca un ruolo importante nella diagnosi allergologica ma i pazienti con asma del panificatore risultano positivi solo lievemente (dal 5 al 15%). Questa scarsa significatività dello SPT potrebbe essere una conseguenza della bassa solubilità di molte proteine del frumento così come un effetto di differenze nella standardizzazione degli estratti analizzati. OBIETTIVO Lo scopo di questo studio era quello di realizzare una caratterizzazione degli allergeni del frumento coinvolti nell’allergia alimentare e inalatoria. In particolare, l’obiettivo di questo studio era di esaminare la variabilità dei profili proteici riconosciuti dalle IgE di panificatori italiani sensibilizzati verso la farina di frumento e di identificare gli allergeni più frequentemente riconosciuti. Inoltre abbiamo voluto i) indagare quali epitopi fossero coinvolti nelle diverse forme di allergia al frumento ii) esaminare il reale contenuto allergenico negli estratti per lo SPT usati nella diagnosi dell’allergia al frumento mettendo in relazione la loro composizione con i risultati diagnostici prodotti. È stata sviluppata come strategia un’analisi proteomica del frumento seguita da IgE blotting cioè un approccio “allergonomico”. METODI per caratterizzare gli allergeni del frumento le proteine di farina di frumento, monocultivar Bolero, solubili in soluzione salina, sono state separate in elettroforesi monodimensionale (1-DE) e bidimensionale (2-DE) in condizioni ridotte e non ridotte. Inoltre, sono stati analizzati gli estratti di farina e di farina integrale usati per lo SPT. Le proteine IgE-specifiche sono state rivelate attraverso immunoblotting usando i sieri di 43 pazienti con allergia inalatoria e 9 con allergia alimentare al frumento. Dopo digestione triptica, sono state analizzate attraverso nano HPLC–ESI–MS/MS i peptidi di alcune proteine IgE-specifiche, frequentemente immunorivelate dalle IgE dopo elettroforesi bidimensionale. RISULTATI Gli immunoblot ottenuti con 43 sieri diversi utilizzati singolarmente presentavano una notevole eterogeneità. Sempre con questa metodica inoltre, sono stati realizzati profili di estratti in condizioni ridotte e non ridotte evidenziando il coinvolgimento di ponti disolfuro nella stabilizzazione dei determinanti. Infine è stato dimostrato che gli estratti usati per lo SPT sono solo parzialmente rappresentativi del reale contenuto allergenico del frumento e differenti lotti di questi estratti mostravano notevoli diversità. Si è inoltre osservato che la maggior parte degli allergeni non sono singoli spot proteici ma erano rappresentati da più isoforme proteiche con peso molecolare simile ma un punto isoelettrico diverso. Cinque dei principali spot proteici IgE-specifici sono stati identificati per mezzo della tecnica nano HPLC–ESI–MS/MS. In questo studio, abbiamo identificato un allergene inalatorio del frumento già riportato in letteratura [monomeric alpha-amylase inhibitor, 0.28]. Inoltre abbiamo identificato due allergeni inalatori del frumento, raramente descritti in letteratura [triosephosphate-isomerase e thioredoxin peroxidase], e abbiamo scoperto due nuovi allergeni mai riportati come tali [glucose and ribitol dehydrogenase homolog – barley e una heat shock protein]. Nel caso dell’allergia alimentare al frumento, sorprendentemente, non ci sono IgE-specifiche per le proteine del frumento in 8 casi su 9 (88%). CONCLUSIONI. La rilevanza clinica dei due nuovi allergeni identificati dovrà essere ulteriormente investigata ma certamente i nostri risultati potrebbero contribuire ad aumentare la specificità dei saggi diagnostici. L’IgE-blotting non ha rilevato allergeni alimentari perciò, nel prossimo futuro, sarà necessario sviluppare un approccio alternativo per lo studio di queste patologie.Wheat flour proteins are allergens involved in 60% to 70% of workplace-related respiratory-symptoms of bakers, furthermore wheat belongs to the six major food allergens inducing IgE-mediated hypersensitivity-reactions. In the case of wheat food-allergy the manifestations range from cutaneous, gastrointestinal, and respiratory symptoms to severe systematic reactions. Despite this allergological relevance the knowledge of wheat allergens at molecular level is scanty. It is nevertheless assumed that conformational and sequential epitopes might be both responsible for wheat allergic reactions. As a consequence of this limited knowledge the diagnosis of wheat allergy is sometime a difficult task. Skin prick tests (SPTs) play an important role in the allergological diagnosis but baker’s asthmatic patients result positives in a limited (from 5 to 15%) range. This scarce SPT predictability may be a consequence of the low solubility of numerous wheat proteins as well as an effect of differences in test-extracts standardization. OBJECTIVE The aim of the present study was to achieve a more detailed and comprehensive characterization of the wheat allergens involved in food allergy and baker’s asthma. In particular, the aim of the study was to investigate the variability of IgE antibody patterns of wheat flour-sensitized Italian bakers and to identify the most frequently recognized allergens. Furthermore i) we tried to verify whether different epitopes are involved in the different forms of wheat allergy ii) we tested the real allergen content in SPT used in wheat allergy diagnosis in relationship to their performance in clinical practice. The employed strategy was the proteomic analysis of wheat followed by IgE blotting i.e. an “allergenomic” approach. METHODS To characterize wheat allergens, water/salt-soluble wheat flour proteins from the monocultivar Bolero were separated by using mono dimensional (1-DE) and 2-dimensional (2-DE) gel electrophoresis under reducing and non-reducing conditions. Furthermore, using 1-DE SPT-solutions, wholemeal wheat flour and flour extracts were separated. IgE-binding proteins were detected by immunoblotting using the sera of 43 patients with inhalant allergy and 9 with food allergy to wheat. After tryptic digestion, the peptides of some IgE-binding proteins, frequently recognized by IgE on 2-DE, were analyzed by nano HPLC–ESI–MS/MS. RESULTS The IgE immunoblots obtained with 43 different sera exhibited a remarkable inter-individual heterogeneity. Furthermore, the immunodetected profiles were very different under reducing and non-reducing condition. The analyzed SPT-solutions demonstrate to be only partially representative of the real allergenic content of wheat and different batch of these extracts show remarkable differences. It was also demonstrated that the majority of the allergens were not single polypeptide spots, but consisted of up to ten isoforms of similar molecular mass but with different isoelectric points. Five of the predominant IgE-binding protein spots were identified by using nano HPLC–ESI–MS/MS. In this study, we identified one already reported wheat inhalant allergen [monomeric alpha-amylase inhibitor, 0.28] by a database search. Moreover we identified two wheat inhalant allergens, rarely described in literature [triosephosphate-isomerase and thioredoxin peroxidase], and we found out two never reported wheat inhalant allergens [glucose and ribitol dehydrogenase homolog – barley and a heat shock protein]. In the case of food allergy, surprisingly, no specific IgEs for wheat proteins were detected in 8 out of 9 cases (88%). CONCLUSIONS. The clinical relevance of the identified 2 new allergens will be further investigated in the near future but certainly our findings could contribute to increase the specificity of diagnostic assays. IgE-blotting did not reveal food allergens for this reason, in the future, an alternative approach to allergomic must be developed