Biological action of two tomato cysteine-rich miniproteins

Fin dal passato i prodotti naturali sono stati utilizzati come rimedio alle malattie. In tempi recenti questi prodotti naturali hanno ricevuto grande attenzione nella prevenzione delle malattie grazie ai loro effetti benefici sulla salute, come ad esempio la bassa tossicità e effetti collaterali minimi. Le miniproteine cystine-knot (CKMs) appartengono ad una grande famiglia di piccole proteine ricche in cisteine diffuse nelle piante e nelle specie animali. CKMs mostrano un vasto spettro di attività biologiche naturali utili da un punto di vista terapeutico, infatti molte di queste CKMs sono commercializzate come agenti terapeutici o sono in vari fasi di sviluppo clinico. CKMs constano tipicamente di meno di 50 aminoacidi e hanno una struttura tridimensionale unica caratterizzata da tre legami disolfuro intramolecolari che formano un “cystine-knot” (nodo di cisteine) e da un piccolo foglietto beta. Il nodo di cisteine agisce come impalcatura per la proteina conferendo a tutte le miniproteine cystine-knot una struttura compatta e sorprendentemente stabile a vari fattori, come pH estremi, denaturazioni chimiche o termiche e attacchi proteolitici. Questa struttura è stata individuata per la prima volta nel 1982 in un inibitore di carbossipeptidasi di patata (PCI). PCI inibisce la carbossipeptidasi pancreatica dei mammiferi e può agire come fattore antitrombotico; inoltre è stato dimostrato che PCI agisce come inibitore della crescita di linee cellulari di adenocarcinoma pancreatico funzionando come antagonista del fattore di crescita umano dell’epidermide legandosi al recettore del fattore di crescita dell’epidermide (EGFR). È stato visto che l’attività dell’EGFR, che è un recettore tirosin-kinasico appartenente alla famiglia ErbB, è aumentata in maniera anomala nella maggior parte dei tumori solidi umani e questa attività anomala è associata con la progressione del tumore e con una prognosi sfavorevole. Oggigiorno è diventato evidente che la via di segnale del EGFR, oltre a un effetto sulla progressione, gioca un ruolo importante anche nell’angiogenesi, ovvero nella formazione di nuovi vasi sanguigni partendo da vasi preesistenti per formare una rete capillare. L’angiogenesi è un evento fondamentale nei processi fisiologici come l’organogenesi, la guarigione delle ferite e la crescita dei muscoli, ma avviene anche in situazioni patologiche dove promuove la crescita e la progressione tumorale, la formazione di metastasi così come la retinopatia diabetica e la psoriasi. Alla luce di ciò è facile intuire che il trattamento anti-angiogenico è considerato una strategia efficace nella terapia tumorale e l’inibizione di EGFR sembra rappresentare un nuovo e promettente approccio. Questa ricerca mira ad investigare l’azione biologica su cellule umane di due miniproteine di pomodoro che sono componenti consueti della nostra dieta. La motivazione di questa ricerca scaturisce dalla scoperta che due miniproteine cystine-knot di pomodoro (TCMPs), di cui una espressa nel fiore (TCMP-1) e una nel frutto maturo (TCMP-2), mostrano similarità di sequenza e struttura con un inibitore di carbossipeptidasi di patata (PCI) che agisce come antagonista di EGF. Poiché EGF è una delle molecole segnale che partecipa alla formazione di nuovi vasi, abbiamo investigato se TCMP-1 e TMCP-2, che sono capaci di legarsi alla superficie di cellule umane, possono esercitare una attività anti-angiogenica avendo contemporaneamente una bassa tossicità cellulare. In questo lavoro abbiamo dimostrato che gli inibitori di carbossipeptidasi cystine-knot di pomodoro, sia in forma naturale che ricombinante, possiedono attività anti-angiogenica in vitro e che questa attività è svolta ad una concentrazione in un range nano molare, range che è di particolare rilevanza biologica. Inoltre i nostri esperimenti hanno provato che le due miniproteine non esercitano alcun effetto tossico sulla proliferazione e vitalità delle cellule endoteliali e che la loro attività anti-angiogenica è associata con l’inibizione dell’attivazione di ERK1/2, suggerendo che TCMPs interferiscano con la via di segnale delle MAPK. In conclusione possiamo dire che poiché gli inibitori di carbossipeptidasi cystine-knot di pomodoro sono presenti nel frutto commestibile, questi composti i dovrebbero essere dotati di bassa tossicità quando testati su modelli animali e sull’uomo; inoltre l’angiogenesi tumorale può rappresentare un target per l’uso terapeutico delle miniproteine di pomodoro e la loro attività anti-angiogenica può essere testata anche per la prevenzione di alter malattie. In base a questi dati e considerazioni le miniproteine di pomodoro possono avere un potenziale interesse farmacologico che merita successivi approfondimenti.Natural products are known since the past as disease remedies. In recent years, natural products have received great attention for disease prevention owing to their various health benefits, including low toxicity and diminished side effects. Cystine-knot miniproteins (CKMs) are members of a large family of small cysteine-rich proteins widespread in plant and animal species. CKMs display a broad spectrum of therapeutically useful natural biological activities and several CKMs are marketed as therapeutics or are in clinical development. CKMs typically consist of less than 50 amino acids and have a unique three-dimensional structure characterized by three intra-molecular disulfide bonds forming a cystine-knot and a small tripled stranded beta-sheet. The cystine-knot acts as structural scaffold for the protein conferring to the cystine-knot miniproteins a compact and remarkably stable structure towards extreme pH, chemical and thermal denaturation, and proteolytic attack. This scaffold was first discovered in 1982 in a carboxypeptidase inhibitor from potato (PCI). PCI inhibits mammalian pancreatic carboxypeptidase and can act as antithrombotic agent. Moreover, it has been shown that PCI also function as inhibitor of pancreatic adenocarcinoma cell lines growth acting as antagonist of the human epidermal growth factor by binding to the epidermal growth factor receptor (EGFR). The activity of the EGFR, that is a tyrosine kinase receptor of the ErbB family, is abnormally elevated in most human solid tumors and has been associated with progression and poor prognosis. Nowadays, it has become clear that the EGFR signaling pathway also plays a key role in angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing vessels to form capillary networks. Angiogenesis is a fundamental event of physiological processes, like organogenesis, wound healing and muscle growth, but it also takes place in pathological situations and promotes tumor growth and progression, metastasis as well as diabetic retinopathy and psoriasis. Therefore, anti-angiogenic treatment is considered a very effective strategy in cancer therapy and inhibition of EGFR seems to represent a novel and promising approach. This research aims to investigate the biological action on human cells of two tomato miniproteins which are normal components of our diet. The motivation for this research stems from the discovery that two tomato cystine-knot miniproteins (TCMPs), one expressed in the flower (TCMP-1) and the other in the mature fruit (TCMP-2), are similar in sequence and structure to a potato carboxypeptidase inhibitor (PCI) that acts as EGF antagonist. Since EGF is one of the signalling molecules participating in the formation of new vessels, we have investigated whether, TCMP-1 and TCMP-2, that can bind to the surface of human cells, could exert anti-angiogenic activity with limited cell toxicity. We have demonstrated that tomato cystine-knot carboxypeptidase inhibitors both native and recombinant, possess anti-angiogenic activity in vitro. The tomato miniproteins act as an anti-angiogenic factor in the nanomolar concentration range, which is of particular biological relevance. Furthermore, our experiments have proved that the two miniproteins do not exert toxic effects on endothelial cell proliferation and viability. Their anti-angiogenic activity is associated with an inhibitory effect on ERK1/2 activation, suggesting that TCMPs interfere with MAPK signaling pathway. Since tomato cystine-knot carboxypeptidase inhibitors are present in edible fruits, these compounds should be endowed with low toxicity when tested in animal models of disease and in humans. Tumorigenic angiogenesis could represent a target for therapeutic intervention with tomato miniproteins, and their anti-angiogenic activity could be tested as well for the prevention of other diseases. On these bases, miniproteins from tomato may be of potential pharmacological interest and deserve further investigation