Study of Candida aquaetextoris (sp. nov. Vallini et al., 1997)degradation ability of nonyl-phenol poly-ethoxylates

I nonilfenoli polietossilati sono tensioattivi non ionici largamente utilizzati nei detergenti delle industrie tessili e conciarie e in molte altre attività industriali. Il loro vasto campo di applicazione è essenzialmente dovuto all'eccellente capacità detergente e solubilizzante unita al loro basso costo. La loro struttura anfifilica è caratterizzata da una parte polare fortemente idrofilica, costituita dal gruppo etossilico (OCH2CH2), e da una parte apolare fortemente idrofoba, costituita dal gruppo alchilico (R). Una volta rilasciati nell'ambiente, i NPEOs sono rapidamente metabolizzati a nonilfenolo dietossilato (NP2EO), nonilfenolo monoetossilato (NP1EO), e nonilfenolo (NP); questi composti secondari sono molto recalcitranti verso altri attacchi microbici e, conseguentemente, si accumulano nei sedimenti, nelle falde e nelle acque di rifiuto. I prodotti di trasformazione derivati dalla degradazione dei NPnEO esercitano un'alta tossicità nei confronti di organismi presenti in acque dolci e marine. In particolare, i NPs sono in grado di interferire con numerose funzioni endocrine attraverso differenti meccanismi quali ad esempio interazioni recettoriali (agonismo od antagonismo), inibizione della sintesi e/o del trasporto di ormoni. A causa dell'importanza ecologica di questi composti, negli ultimi anni molti microorganismi degradatori di NPnEO (Pseudomonas sp., Stenotrophomonas sp., Phanerochaete sp. ecc) sono stati isolati da diverse matrici ambientali; tra questi, riveste grande importanza Candida aquaetextoris, un ceppo isolato dai reflui di un'industria tessile di Prato, che risulta essere, fino ad oggi, l'unico lievito studiato in grado di biotrasformare il 4-n-NP. Nel corso degli ultimi anni sono stati isolati molti microorganismi degradatori dei nonilfenoli, tuttavia ci sono ancora scarse informazioni riguardanti il metabolismo microbico dei nonilfenoli. A questo proposito, il presente studio si è posto due obiettivi principali: 1. Definire meglio la collocazione filogenetica di C. aquaetextoris; 2. Studiare l'abilità di Candida aquaetextoris nella degradazione del NP9EO e del tNP, in modo da far luce sul metabolismo microbico degli idrocarburi aromatici alchil-sostituiti. Dal sequenziamento parziale del 18S rDNA di C. aquaetextoris e dalla successiva analisi in banca dati sono stati selezionati 7 ceppi appartenenti all'intorno filogenetico di C. aquaetextoris: C. viswanathii CBS 4024, C. neerlandica CBS 434, C. sojae CBS 7871, C. haemulonii CBS 8125, C. tropicalis CBS 94, C. maltosa CBS 5611 e C. maltosa CBS 5612. Sulla scorta di queste informazioni, il progetto di ricerca è stato sviluppato attraverso alcuni punti: 1. Indagine tassonomica, in modo da determinare con precisione la collocazione filogenetica del lievito C. aquaetextoris all'interno del genere Candida; 2. Studio del comportamento dei lieviti selezionati in presenza di NP9EO e tNP attraverso cinetiche di crescita e test di tossicità, con lo scopo di verificare se determinate caratteristiche siano tipiche di C. aquaetextoris oppure siano ascrivibili al genere Candida; 3. Analisi della capacità degradativa di C. aquaetextoris nei confronti del NP9EO e del tNP; 4. Indagini molecolari per la determinazione di geni target coinvolti nel processo di biotrasformazione e/o degradazione del lievito studiato; 5. Studio della capacità degradativa di C. aquaetextoris in consorzio con altri ceppi batterici ipotetici degradatori di nonilfenoli. Dalle analisi molecolari condotte è emersa un’alta similarità tra la specie C. aquaetextoris e C. viwanathii. Le differenze riscontrate durante l'analisi cariotipica hanno permesso di considerare C. aquaetextoris come un ceppo diverso dal type strain C. viswanathii CBS 4024. Oltre che per una collocazione più precisa di C. aquaetextoris all'interno del genere Candida, questo studio tassonomico è stato molto importante per chiarire la presenza di C. aquaetextoris negli impianti di trattamento delle acque reflue: molti ceppi di C. viswanathii, infatti, sono stati isolati negli WWTP. Un altro dato significativo emerso da questa indagine riguarda la capacità di alcuni ceppi di C. viswanathii di degradare chetoni attraverso l'azione di una carbonil riduttasi. In particolare, alcuni ceppi di C. viswanathii sono capaci di ridurre l'1-acetonaftone che è un composto molto simile al 4- idrossiacetofenone: quest'ultimo composto è il principale metabolita che si accumula nella via di degradazione del 4-n-NP da parte di C. aquaetextoris. In questo senso, l'azione combinata di questi due lieviti potrebbe essere in grado di portare a completa mineralizzazione 4-n-NP. A differenza degli altri ceppi testati, C. aquaetextoris si è dimostrata essere particolarmente resistente nei confronti dei nonilfenoli in condizioni colturali differenti. Comunque, è stato visto che un periodo di acclimatazione con concentrazioni sub-letali di nonilfenoli aumenta la resistenza anche nelle colture degli altri lieviti testati. In generale, dopo analisi microbiologiche, chimiche e molecolari è stato possibile tracciare alcuni pathway degradativi propri di C. aquaetextoris e fare così chiarezza sulle caratteristiche metaboliche di questo lievito, che possiamo riassumere in alcuni punti: 1. Assenza di degradazione della catena etossilica, che sembra essere un meccanismo tipico di alcuni procarioti; 2. Impossibilità di attacco di catene alchiliche complesse; 3. Degradazione di catene lineari alchiliche e successiva degradazione dei composti fenolici. La presenza di batteri degradatori della catena etossilica non sembra favorire il processo degradativo di C. aquaetextoris probabilmente a causa della catena alchilica ramificata. Da un punto di vista ecologico, risulta comunque interessante la presenza, negli impianti di trattamento delle acque reflue, di ceppi al genere Sinorhizobium/Rhizobium conosciuti in letteratura soprattutto per l'associazione simbiontica con l'apparato radicale delle piante. Dopo questo studio, è possibile tracciare uno schema generale sui pathway degradativi che coinvolgono la degradazione e/o biotrasformazione dei NPnEO. Dopo un primario e parziale attacco batterico nei confronti dei nonil-fenoli poli-etossilati, si possono formare molti intermedi di reazione, tra cui nonilfenoli con catena alchilica lineare e/o ramificata e con corta catena etossilica, come dimostrato dalle prove microbiologiche e chimiche effettuate su ceppi batterici isolati. Successivamente, alcuni isomeri con catena alchilica ramificata possono subire un successivo parziale attacco ad opera di ceppi batterici appartenenti al genere Sphingomonas, mentre altri isomeri rimangono non degradati. In questo senso, microorganismi come C. aquaetextoris possono rivestire un ruolo significativo nella completa mineralizzazione dei fenoli non degradati e di alcuni isomeri dei NPs, tra cui il 4-n-NP. La presenza di questo lievito nella acque reflue risulta comunque importante per alcuni motivi: 1. Innanzi tutto è in grado di tollerare alte concentrazioni di nonilfenoli e, per questa ragione, è capace di rispondere meglio a variazioni climatiche o colturali; 2. In secondo luogo, a differenza degli organismi fungini, si adatta meglio all'habitat acquatico e può svolgere, per questo motivo, un'azione efficace nei confronti di alcuni composti tossici (tra cui il 4-n-NP). In generale, si può concludere che la presenza di più microrganismi appartenenti a taxa differenti e con pathway degradativi molto diversi tra loro possono cooperare per la completa degradazione di molte sostanze tossiche e nocive per l'uomo e l'ambiente, come nel caso dei nonil-fenoli poli-etossilati.Nonylphenols are restive compounds that are able to mimic the 17-ß-estradiol and cause numerous toxic effects towards organisms and microorganisms. For these reasons, many strategies to remove them from environment have been studied and tested with different results. Their presence in the sewage treatement plants is the main problem of their environment diffusions and - on the basis of this - the best bioremediation strategy seems to be the degradation of nonylphenols directly inside the STW. For this purpose, many microorganisms capable to biotrasform nonylphenols through different metabolic pathways have been isolated from different matrices and studied for their degradation potential. C. aquaetextoris is an ascomycota isolated from a wastewater treatment plant (Italy, Tuscany) and studied mainly for its ability to biotrasform 4(1-nonyl)phenol using it as sole carbon and energy source. On the basis of these informations, the general aims of this work are: 1) to determine the taxonomic position of C. aquaetextoris in the genus Candida; 2) to study the biodegradation capability of C. aquaetextoris towards different types of nonylphenols in order to better clarify the microbial metabolism of this class of surfactants. Starting from the C. aquaetextoris 18S rDNA partial sequence were choosed seven Candida strain: C. tropicalis CBS 94, C. neerlandica CBS 434, C. viswanathii CBS 4024, C. maltosa CBS 5611, C. maltosa CBS 5612, C. sojae CBS 7871 and C. haemulonii CBS 8125. The taxonomic analysis showed the high similarity between C. aquaetextoris and C. viswanathii CBS 4024 underlining the possibility to group them into the same species. On the other hand, the microbiological tests showed that all the Candida sp. strains tested were unable to grow in presence of NP9EO or tNP as sole carbon and energy source. However, C. aquaetextoris remarked a higher resistance to the toxic effects exerted by NPs when compared with the other Candida sp. strains in different growth conditions. Eventually, chemical and microbiological analysis demonstrated that C. aquaetextoris is not capable to degrade the ethoxylate mojety or branched alkyl chain, but only n-alcane chain that are present in 4-n-NP. Also in presence of ethoxy chain-NPs degrading bacteria - isolated from STW of Prato (Italy, Tuscany) - C. aquaetextoris was unable to attack the complex alkylic chain and biotransform the phenol ring