Persistance of Vibrio cholerae and other vibrios in the aquatic environment and link with pathogenicity for humans

Nei primi anni ’80 un gran numero di evidenze sperimentali ha confermato che i microrganismi, anche patogeni, appartenenti al genere Vibrio sono batteri autoctoni dell’ambiente acquatico. A partire da allora l’ecologia acquatica dei vibrioni è stata largamente studiata ed è stato messo in evidenza come l’ambiente acquatico abbia un ruolo fondamentale nel determinare la persistenza, la disseminazione e l’evoluzione di questi microrganismi, e conseguentemente la loro trasmissione all’uomo. La presenza di vibrioni nell’ambiente acquatico è correlata ai valori di temperatura, di salinità e di materia organica disciolta, nonché alla presenza di serbatoi ambientali (ad esempio, le superfici chitinose degli organismi zooplanctonici) e di siti di concentrazione (ad esempio, i tessuti dei bivalvi), a loro volta soggetti alle variazioni climatiche. L’identificazione delle nicchie ecologiche ospitanti i vibrioni nell’ambiente marino, così come la conoscenza dei fattori alla base della loro persistenza, sono quindi di fondamentale importanza nello studio dell’ecologia di tali microrganismi. Partendo da questi presupposti i principali obiettivi del mio studio sono stati: la valutazione del ruolo delle differenti matrici ambientali come serbatoio di Vibrio spp. e vibrioni patogeni nelle acque costiere del Mar Ligure e l’identificazione dei principali fattori ambientali in grado di influire sulla loro presenza e distribuzione. Inoltre, considerando l’importanza dello zooplancton (es. copepodi ) nel determinare la persistenza dei vibrioni nell’ambiente acquatico e il ruolo dei bivalvi nella concentrazione e trasmissione all’uomo di tali batteri, un altro obiettivo del mio lavoro è stato lo studio dei fattori coinvolti nella loro interazione con la chitina e gli organismi filtratori, utilizzando come modello di studio Vibrio cholerae. E’ stato in particolare evidenziato come la persistenza di questo batterio all’interno dei bivalvi possa influenzare la sua patogenicità nell’uomo. Al fine di indagare il ruolo delle differenti matrici marine come serbatoio di Vibro spp e delle differenti specie patogene (V. cholerae, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus) abbiamo condotto uno studio di 16 mesi nel Golfo di La Spezia durante il quale abbiamo analizzato i principali fattori ambientali in grado di influenzare la presenza, la concentrazione e la distribuzione di questi microrganismi nell’ambiente acquatico. Le analisi microbiologiche sono state condotte su campioni di acqua di mare, mitili, sedimento e zooplancton e le variabili considerate sono state la temperatura superficiale dell’acqua (SST), la salinità e la concentrazione di clorofilla-a e proteine disciolte. I risultati ottenuti, oltre a confermare la relazione esistente fra le variazioni ambientali e la presenza e coltivabilità dei vibrioni nell’ambiente acquatico, hanno evidenziato come il sedimento possa svolgere un ruolo di serbatoio addizionale di vibrioni che, in questa matrice, sono meno sensibili ai fattori ambientali. Questo è probabilmente dovuto alle intrinseche caratteristiche di questa matrice, che la rendono meno soggetta alle variazioni stagionali dell’ambiente circostante. Considerando la correlazione fra presenza di vibrioni nelle acque e fattori ambientali, è stato valutato l’effetto della temperatura e della salinità sull’adesione di V. cholerae a particelle di chitina. I risultati ottenuti hanno mostrato come l’adesione di V. cholerae alla chitina sia influenzata dalle variazioni di temperatura e non dalle variazioni della concentrazione di NaCl. Questi risultati sono stati confermati dall’analisi, effettuata mediante Real Time RT-PCR, dell’espressione genica dei geni Gbp (gbpA) e MSHA (mshaA) in diverse condizioni ambientali. Infatti l’espressione di tali geni ha dimostrato di essere influenzata dalle variazioni di temperatura ma non di salinità e concentrazione di nutrienti. I risultati ottenuti permettono di ipotizzare che le basse concentrazioni di vibrioni nelle acque costiere durante il periodo invernale possano essere ricondotte, almeno in parte, all’effetto della temperatura sull’espressione dei geni codificanti per ligandi di superficie coinvolti nell’adesione al substrato chitina. Per quanto riguarda invece le interazioni di V. cholerae con gli organismi filtratori, è necessario tenere presente che precedenti studi hanno dimostrato come la persistenza dei microrganismi all’interno dei tessuti dei bivalvi dipenda dalla loro capacità di sopravvivere all’attività battericida dell’emolinfa dei mitili. Inoltre, è stato dimostrato che l’adesina MSHA (Mannose Sensitive Hemagglutinin) espressa dai ceppi di V. cholerae El Tor è in grado di mediare l’adesione e il conseguente killing da parte degli emociti di Mytilus galloprovincialis; queste interazioni avvengono attraverso specifiche opsonine presenti nel siero di emolinfa. Al fine di identificare le molecole opsonizzanti, specifiche per MSHA, coinvolte in questo meccanismo, il siero di emolinfa è stato separato mediante una colonna di affinità preparata con particelle di agarosio precedentemente rivestite con V. cholerae MSHA-positivo e il materiale trattenuto è stato successivamente eluito con una soluzione di D-mannosio 0.5 M. Il risultato di tale procedimento di estrazione, analizzato mediante SDS-PAGE al 12%, ha messo in evidenza una singola frazione di siero di circa 42 kDa capace di mediare l’interazione fra V. cholerae MSHA-positivo e gli emociti di mitilo. Sorprendentemente la medesima frazione si è dimostrata anche capace di incrementare l’adesione di tale microrganismo a cellule intestinali umane in coltura. L’aggiunta di D-mannosio ha annullato entrambi gli effetti. Inoltre, i nostri studi hanno evidenziato come questa frazione di siero, legandosi alla parete cellulare di V. cholerae, protegga tale microrganismo da eventuali shock acidi. E’ da sottolineare come questo effetto potrebbe giocare un ruolo fondamentale nell’incrementare la sopravvivenza di V. cholerae nell’uomo, per esempio, durante il passaggio attraverso lo stomaco. Questi risultati permettono di ipotizzare che la capacità di V. cholerae di colonizzare l’intestino umano sia dovuta in parte a proprietà intrinseche del batterio e in parte a fattori acquisiti durante la sua permanenza nell’ambiente acquatico. In conclusione, i dati presentati in questa tesi possono contribuire all’approfondimento della comprensione dell’ecologia dei vibrioni e rappresentare la base per lo sviluppo di nuove strategie di controllo della diffusione dei vibrioni patogeni nelle acque marine costiere e, conseguentemente, prevenire la loro trasmissione all’uomo.In the early 80's, evidences rapidly accumulated showing unequivocally that pathogenic Vibrio species are naturally occurring in the aquatic environment. Since then, significant effort has been devoted to the study of the aquatic ecology of vibrios, the conclusion of which is that the aquatic environment plays a pivotal role in persistence, dissemination and evolution, as well as transmission to humans, of these bacteria. In water, Vibrio abundance is related to temperature, salinity, and concentration of organic matter, and it is tightly dependent on the presence of environmental reservoirs (e.g., zooplankton crustacea) and concentration sites (e.g., tissues of filter feeding organisms), which are in turn controlled by climate variability. The identification of environmental niches hosting vibrios in the environment as well as the knowledge of the factors controlling their occurrence are thus of fundamental importance to the study of Vibrio ecology. Based on these observations, the principal aims of my study have been: to evaluate the role of different environmental matrices as reservoir of Vibrio spp. and pathogenic vibrios in Ligurian Sea coastal waters, and to reveal the major environmental factors controlling their presence and distribution. Moreover, considering the importance of both chitin-containing organisms (e.g., copepods) in Vibrio persistence inside the water, and bivalves as a route of pathogen concentration and transmission to humans, special attention has been given to the study of factors affecting their interactions with chitin and bivalves, using Vibrio cholerae as a study model. The possible influence of persistence in bivalves in pathogenicity for humans of this microrganism has also been studied. To investigate the role of different marine matrices as reservoirs of Vibrio spp. and pathogenic species (V. cholerae, Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolitycus), we have carried out a 16 months study in the La Spezia Gulf and have analysed the major environmental factors controlling their presence, abundance and distribution in the aquatic environment. Microbiological analysis has been performed on water, mussel, sediment and zooplankton samples and the considered environmental variables were Sea Surface Temperature (SST), salinity, concentration of chlorophyll-a and concentration of proteins. The obtained data, while confirming the dependence of Vibrio presence and culturability on environmental variables, have also shown that the sediment can act as an additional reservoir of vibrios which, in this compartment, are less sensitive to the environmental factors. This is probably due to sediment intrinsic characteristics that make this matrix less sensitive to season environmental variations. Considering the strong link between Vibrio presence in water and environmental factors, we have evaluated the effect of temperature and salinity on V. cholerae binding to chitin. The obtained results have shown that V. cholerae binding to chitin is affected by temperature, while salinity does not have any effect. Similar results have been obtained by Real Time RT PCR analysis of Gbp (gbpA) and MSHA (mshaA) gene expression in different environmental conditions. In fact, we have found that gbpA and mshaA expression varies with temperature but is not affected by salinity and nutrient concentration. These findings suggest that low Vibrio concentrations in coastal water in winter period can be ascribed, at least in part, to temperature effect on expression of genes encoding for surface ligands involved in adhesion to chitin surfaces. Concerning the results on V. cholerae interactions with mussels, it must be recalled that previous studies suggested that bacterial persistence in bivalve tissues depends, at least in part, on the capability to survive to the bactericidal activity of the mussel blood, the hemolymph. It has been previously shown that MSHA (Mannose Sensitive Hemagglutinin) expressed by V. cholerae El Tor strains mediates adherence to, and killing by Mytilus galloprovincialis hemocytes; such interactions occur via specific opsonins(s) present in mussel hemolymph serum. In order to identify the opsonizing serum component binding the MSHA ligand, mussel serum has been applied to a V. cholerae (MSHA-positive) - agarose affinity column and the bound material has been eluted with 0.5 M D-mannose. The resulting eluate, analyzed by 12% SDS-PAGE, yielded a single fraction of approximately 42 kDa which has beenshown to mediate MSHA-positive V. cholerae interactions with hemocytes and, surprisingly, also adherence to cultured intestinal cells. Addition of D-mannose has abolished such increase. Moreover, our studies have shown that binding of p42 fraction to V. cholerae cell wall induces a protective effect to acid shock. This effect can play a fundamental role in the increase of V. cholerae survival during infection of human host, i.e., after the organism has passed through the stomach. These results suggest that V. cholerae capability to colonize human intestine depends on both bacterial intrinsic properties and factors acquired during its persistence in the aquatic environment. In conclusion, data presented in this thesis can contribute to a better comprehension of Vibrio ecology and represent the basis for the development of new strategies to control the diffusion of pathogenic vibrios in coastal marine environment and to prevent their transmission to humans