Ocorrência, diversidade e efeitos evolutivos do endossimbionte Wolbachia (ANAPLASMATACEAE) em espécies neotropicais de Drosophila do subgrupo willistoni

Wolbachia é uma α-proteobactérias da família Anaplasmataceae que vive em simbiose no interior de células de invertebrados, a maioria deles espécies de insetos. Em espécies de Drosophila, Wolbachia pode causar dois fenótipos de parasitismo reprodutivo, incompatibilidade citoplamsmática e a morte do macho, além de outros fenótipos que afetam o fitness do hospedeiro. São estratégias usadas pelo endossimbionte para aumentar sua frequência na população da espécie hospedeira as quais podem ter consequências evolutivas para a mitocôndria, que com ela é co-herdada e para o fluxo gênico. O subgrupo willistoni, pertencente ao subgênero Sophophora, é um conjunto de espécies crípticas, neotropicais e filogeneticamente relacionadas. Este subgrupo é formado pelas espécies Drosophila willistoni, Drosophila paulistorum, Drosophila equinoxialis, Drosophila tropicalis, Drosophila insularis e D. pavlovskiana. As relações evolutivas entre estas espécies são bem resolvidas em filogenias moleculares usando genes nucleares, porém as reconstruções com marcadores mitocondriais mostram incongruências que refletem uma diferente história evolutiva do genoma mitocondrial. Screenings usando principalmente linhagens de laboratório encontraram Wolbachia em D. willistoni, D. tropicalis e D. paulistorum. Em D. willistoni e D. tropicalis foi encontrada uma variante de Wolbachia denominada wWil, enquanto que na superespécie D. paulistorum, foram encontradas diferentes linhagens de Wolbachia em diferentes semiespécies do complexo. Contudo, pouco se sabe sobre a ocorrência, diversidade e efeitos evolutivos em populações naturais. Este estudo tem como objetivo contribuir para o conhecimento da relação de Wolbachia com espécies do subgrupo da Drosophila willistoni. Varreduras foram realizadas com PCR diagnóstica e Dot-blot tanto em amostras de populações naturais quanto em linhagens de laboratório Os resultados iniciais usando somente PCR mostraram 55% da amostra de D. willistoni, coletada no bioma Mata Atlântica no sul do Brasil, infectada por Wolbachia. Também foi constatado que o endossimbionte estava associado a diferentes haplótipos mitocondriais o que sugere infecção por transmissão horizontal. Não foi encontrada evidência que Wolbachia diminuiu a diversidade mitocondrial nesta espécie. Já nas amostras diagnosticadas com PCR e Dot-blot, todas as linhagens de D. willistoni, D. paulistorum, D. equinoxialis, mostraram sinal de infecção no Dot-blot, porém a maioria delas falhou na amplificação do gene wsp (Wolbachia Surface Protein). Isto sugere diferentes níveis de infecção, tanto intraespecíficos quanto interespecíficos. Desta situação, a técnica de Dot-blot é mais adequada para a detecção de Wolbachia do que a PCR padrão. Em D. willistoni, a infecção wWil foi detectada tanto em amostras do sul quanto do norte do Brasil, mostrando uma infecção de proporções continentais. Em D. tropicalis foi caracterizada a infecção wAu, de D. simulans. Pela primeira vez foi encontrada D. equinoxialis abrigando Wolbachia, sendo que a variante detectada é relacionada a wMel de D. melanogaster. Uma linhagem de laboratório de D. paulistorum Amazônica também mostrou estar infectada por uma variante wMel. Com isso, há evidências de transmissão horizontal de variantes de Wolbachia entre espécies de Drosophila do velho mundo e neotropicais O sequenciamento de região 5’ do gene COI (Citocromo Oxidase Subunidade I), mostrou um complexo padrão de variação no mtDNA no subgrupo willistoni. Foi encontrado um haplótipo compartilhado entre D. willistoni e D. insularis, o que constitui evidência de introgressão. Associação com Wolbachia pode ter levado a diminuição da diversidade haplotípica em D. equinoxialis. Devido à complexa evolução mitocondrial, as distâncias genéticas de COI não separam corretamente as espécies. O gene nuclear kl-3 é sugerido como um DNA Barcoding para a identificação molecular destas espécies.Wolbachia is an α-proteobacterium from the Anaplasmataceae family, and lives in symbiosis inside invertebrate cells, mostly from insect species. In Drosophila species, Wolbachia may cause two reproductive parasitism phenotypes: cytoplasmic incompatibility and male killing, besides some other phenotypes that can affect the host fitness. These phenotypes are strategies employed by the endosymbiont in order to increase its own frequency in the host population, which can cause evolutionary consequences for the mitochondria, since the bacterium is co-inherited with it, and for the gene flow. The willistoni subgroup, belonging to the Sophophora subgenus, is a group of cryptic Neotropical species, which are all phylogenetically related. This subgroup is formed by the species Drosophila willistoni, Drosophila paulistorum, Drosophila equinoxialis, Drosophila tropicalis, Drosophila insularis and D. pavlovskiana. The evolutionary relationships between these species are well resolved in molecular phylogenies when using nuclear genes. On the other hand, reconstructions using mitochondrial markers show incongruences that reflect a different evolutionary history of the mitochondrial genome. Screenings mainly using laboratory lines found Wolbachia infection in D. willistoni, D. tropicalis and D. paulistorum. In D. willistoni and D. tropicalis it was found a Wolbachia variant called wWil, while in the superspecies D. paulistorum were found different Wolbachia lines according to each semispecies from the complex. However, little is known about the occurrence, diversity and evolutionary effects of Wolbachia in natural populations of Drosophila This study aims to contribute to the knowledge regarding the relationships of this endosymbiont with species from the Drosophila willistoni subgroup. Screenings were performed with diagnostic PCR and Dot-blot either in samples from natural populations and also from laboratory lines. Initial results using PCR only showed that 55% of the D. willistoni sample, collected in the Atlantic Forest biome in southern Brazil, was infected with Wolbachia. It was also found that the endosymbiont was associated to different mitochondrial haplotypes, suggesting an infection by horizontal transmission. We did not find any evidence suggesting that Wolbachia decreased the mitochondrial diversity in this species. In the samples diagnosed with PCR and Dot-blot, all lines of D. willistoni, D. paulistorum and D. equinoxialis showed sign of infection in the Dot-blot, however, most of them failed in the wsp (Wolbachia Surface Protein) gene amplification. This suggests different levels of infection, either intra and interspecific. Therefore, we assume that the Dot-blot technique is more suitable for Wolbachia detection than standard PCR. In D. willistoni, the wWil infection was detected either in samples from the South and the North of Brazil, showing an infection with continental proportions. In D. tropicalis it was characterized the wAu infection, originally from D. simulans. For the first time it was found D. equinoxialis to be hosting Wolbachia, and the variant found is related to wMel from D. melanogaster A laboratory line of D. paulistorum Amazonian also showed to be infected with a wMel variant, so there is evidence of horizontal transmission of Wolbachia variants between Old World and Neotropic Drosophila species. Sequencing of the 5’ region from the COI (Citocromo Oxidase Subunidade I) gene showed a complex pattern of variation in the mtDNA from the willistoni subgroup. It was found a haplotype shared between D. willistoni and D. insularis, which constitutes evidence for introgression. Association with Wolbachia may have led a decrease in the haplotype diversity in D. equinoxialis. Due to a complex mitochondrial evolution, the COI genetic distances do not correctly separate the species. The nuclear gene kl-3 is suggested as a DNA barcoding to the molecular identification of these species