Genes-referência e expressão de transportadores de auxina durante a rizogênese adventícia em Eucalyptus sp.

O uso industrial do eucalipto é uma atividade que está em franca expansão principalmente devido ao seu potencial como matéria-prima para a produção de papel e celulose. As florestas comerciais de eucalipto são geralmente constituídas por meio da propagação vegetativa de materiais elite, sendo necessário um enraizamento adventício eficaz para o estabelecimento das plantas. Dentre os vários fatores que podem afetar a competência ao enraizamento adventício, a auxina tem um papel central, principalmente associado ao conteúdo endógeno e taxa de transporte deste fitormônio. Eucalyptus globulus e seus híbridos interessam à indústria de papel e celulose do Sul do Brasil devido a características como o baixo teor de lignina, facilitando a obtenção de celulose, e a relativa tolerância à geada, comum na região. Entretanto, o enraizamento desta espécie é recalcitrante, sendo necessária a aplicação de auxina exógena para a obtenção de enraizamento satisfatório. Eucalyptus grandis é a espécie mais plantada no Brasil atualmente e possui entre suas características uma boa propensão ao enraizamento espontâneo sem suprimento de auxina exógena, sendo utilizada neste estudo com fins comparativos. Como parte inicial de uma investigação para analisar a base molecular da recalcitrância de E. globulus à propagação clonal, foi realizada uma análise para identificar genes adequados ao uso como controles endógenos em estudos de expressão gênica durante o enraizamento utilizando qPCR. Esta análise permitiu a realização de estudos subseqüentes acerca do padrão de expressão de genes sabidamente relacionados com ação de auxina e enraizamento adventício em outras espécies de plantas, notadamente Arabidopsis thaliana Os resultados indicaram a utilização das combinações dos genes codificantes da Histona H2B e da Alfa-Tubulina e da Histona H2B e da Actina 2/7 como os mais adequados para serem utilizados como referências em estudos com E. globulus e E. grandis, respectivamente. Estes resultados foram validados através da análise da expressão do gene codificador da proteína Argonaute 1, envolvida no metabolismo de auxinas endógenas e regulação de fatores de transcrição responsivos à auxina em Arabidopsis. O perfil de expressão do gene codificador do transportador de influxo de auxina AUX1 em E. globulus indicou que provavelmente este gene não é crítico para o processo de enraizamento adventício. O fator limitante parece ser o transporte de efluxo da auxina da célula para redistribuição e focalização deste fitormônio na base das microestacas, como ficou evidenciado pelo padrão de expressão do gene codificador do transportador de efluxo de auxina PIN1. O aumento na expressão de PIN1 no início do processo de enraizamento em microestacas de E. globulus submetidas a aporte de auxina exógena, sugere a ação deste transportador para concentrar a auxina e permitir o estabelecimento de novos meristemas de raiz. Em E. grandis, o aumento na expressão de PIN1 em microestacas submetidas a 96h de exposição à auxina exógena provavelmente se deve à necessidade de remobilização e re-localização da auxina excedente. Análises comparativas do teor endógeno de auxina nestas espécies, bem como investigação da expressão de genes e proteínas envolvidos na sua biossíntese e sinalização, poderão contribuir para um melhor entendimento do papel deste fitormônio no fenótipo rizogênico de Eucalyptus.The industrial use of Eucalyptus is an expanding activity, mainly due to its use for paper and cellulose production. Commercial eucalyptus forests are generally the product of vegetative propagation of elite materials, requiring effective adventitious rooting for plant establishment. Among the many factors that may affect adventitious rooting competence, auxin plays a key role, particularly related to its endogenous content and transport rate. Eucalyptus globulus and its hybrids are targets for forestry industries in Southern Brazil, mainly due to characteristics such as low lignin content and relative frost tolerance. However, this species is recalcitrant to rooting, requiring the application of exogenous auxin to obtain consistent adventitious root development. Eucalyptus grandis is currently the most planted species in Brazil, rooting promptly from microcuttings without exogenous auxin, and used in this research for comparative purposes. As an initial step of an investigation to analyze the molecular basis of E. globulus recalcitrance to clonal propagation, an analysis was carried out to identify adequate genes to use as endogenous controls in gene expression studies during adventitious rooting monitored by qPCR. This analysis allowed subsequent studies concerning the expression pattern of genes related to auxin action and adventitious rooting in other plant species, particularly Arabidopsis thaliana. The results indicated that combinations of genes encoding Histone H2B and Alpha-Tubulin and Histone H2B and Actin 2/7, could be used as reliable expression normalizers in rooting studies with E. globulus and E. grandis, respectively .These normalizers were validated by analyzing the expression of the gene encoding the Argonaute 1 protein, related to the metabolism of endogenous auxins and regulation of auxin response transcriptions factors in Arabidopsis. Expression of the gene encoding the auxin influx carrier AUX1 in E. globulus indicated that this gene is probably not critical to the adventitious rooting process. The limiting factor seems to be the expression of the auxin efflux transporter, necessary for auxin removal from the cell and presumably to allow redistribution and focalization of the phytohormone at the target tissues in the microccuting basis. This was supported by the expression profile of the gene encoding the auxin efflux carrier PIN1. The increase in PIN1 expression at the beginning of the rooting process in E. globulus microcuttings under exogenous auxin supply suggested the requirement of this carrier to concentrate auxin and to allow the establishment of new root meristems. In E. grandis, however, the late increase of PIN1 expression in microcuttings submitted to 96h of exogenous auxin exposure is probably due to the need for remobilization and re-location of auxin surplus. Comparative analysis of the auxin endogenous content in these species, as well concerted investigations of expression profiles of transcripts and proteins involved with auxin biosynthesis and signaling, may help achieve a better understanding of the role of this phytohormone in determining adventitious rooting phenotypes in Eucalyptus