Caracterização funcional de três fatores de transcrição DOF de Eucalyptus grandis

As proteínas Dof (ligação ao DNA com um dedo, do inglês, DNA binding with One Finger) compreendem uma família de fatores de transcrição exclusiva de plantas, caracterizadas pela presença de um domínio de ligação ao DNA semelhante ao domínio ‘dedo-de-zinco’. Estas proteínas estão associadas a diferentes processos biológicos vegetais como germinação, florescimento e outros. O objetivo principal do presente trabalho foi a caracterização funcional de três fatores de transcrição Dof de Eucalyptus grandis a fim de avaliar a função dos mesmos na biogênese do sistema vascular desta planta. Baseado em resultados prévios do nosso grupo, foram escolhidos três genes (EgD01698, EgD00607 e EgK00405) que apresentaram um perfil de expressão significativo em tecidos vasculares de caules de E. grandis e, também, alta homologia a genes Dof previamente caracterizados em tecidos vasculares de outros vegetais. As regiões codificadoras desses genes foram amplificadas por PCR e clonadas no vetor de entrada pENTR/D-TOPO (Invitrogen). Por recombinação, os genes foram transferidos para o vetor pH7WG2D (VIB) para expressão em Arabidopsis thaliana. Os genes Dof também foram clonados no vetor pGEX-4T-1 (GE Healthcare) para a expressão heteróloga em Escherichia coli Plantas de A. thaliana foram transformadas com os vetores binários pelo método de imersão floral e as sementes foram selecionadas com o antibiótico higromicina. Apenas duas plantas para o gene D00607 e duas para o gene K00405 foram obtidas. As plantas transgênicas estão atualmente sob cultivo para serem geradas linhagens homozigotas e, assim, caracterizadas molecularmente. Além disso, a localização subcelular foi verificada pela expressão transiente de Dof::GFP em folhas de Nicotiana benthamiana. A expressão de GFP foi detectada difusa no citoplasma e no núcleo. Entretanto, esses ensaios deverão ser repetidos para confirmação dos resultados. Em paralelo, células de E. coli BL21 (DE3) pT-GroE foram transformadas com os vetores pGEX-4T-1-D01698 e pGEX-4T-1-D00607. A expressão gênica foi induzida durante 20 h a 20oC com 1 mM IPTG. As proteínas foram detectadas na fração solúvel por SDS-PAGE e western blot e, posteriormente, purificadas por cromatografia de afinidade. A expressão bem sucedida das proteínas Dof em E. coli permitirá a produção dessas proteínas para futuros estudos de caracterização funcional.DNA binding with one finger (Dof) proteins comprehend a family of plant exclusive transcription factors characterized by the presence of the Dof DNA binding domain whose structure is similar to the zinc finger domain. They are associated with diverse biological plant processes such as germination, flowering and many others. The aim of this work was to functionally characterize three Dof genes from Eucalyptus grandis in order to evaluate their role in the biogenesis of vascular system. Based on previous results related to the E. grandis Dof gene family studies obtained by our group, we chose three genes (D01698, D00607 and K00405) with higher expression profile in vascular tissues of E. grandis stalk, as well as with higher homology to Dof genes previously characterized as critical to the genesis of vascular tissues. The CDS of these genes were amplified by PCR and cloned into pENTR/D-TOPO entry vector (Invitrogen). Via recombination, Dof genes were then transferred to the pH7WG2D binary vector (VIB) for the expression in Arabidopsis thaliana. They were also cloned into the pGEX-4T-1 vector (GE Healthcare) for Escherichia coli recombinant gene expression. A. thaliana plants were genetically transformed with recombinant binary plasmids by the floral dip method and seeds were selected by hygromycin resistance Only two plants for the D00607 gene and two plants for the K00405 gene were obtained. Plants are being cultivated in order to obtain homozygous individuals and they will be molecularly characterized. Additionally, subcellular localization was verified by transient expression of Dof::GFP in Nicotiana benthamiana and the expression of GFP was detected at the cytoplasm and nucleus. However, these assays need to be repeated in order to confirm the previous results. In parallel, E. coli BL21 (DE3) pT-GroE cells were transformed with pGEX-4T-1- D01698 and pGEX-4T-1-D00607. Gene expression was induced for 20 h at 20 oC with 1 mM IPTG for protein production. Proteins were detected in the soluble fraction by SDS-PAGE and western blot analysis and then were purified by affinity chromatography. The successful expression of Dof proteins in E. coli provides a way to produce these proteins for future functional characterization studies