Γονιδιακή ανάλυση και ταξινόμηση των ιών ηπατίτιδας C. Κλινικοεργαστηριακές συσχετίσεις

Hepatitis C virus (HCV) is the cause of a chronic hepatitis that may frequently evolve into cirrhosis or hepatocellural carcinoma. In recent years many attempts of treating hepatitis C have been made with interferon, either alone or in combination with various drugs. Treatment response however is not uniform and factors determining a favourable outcome are still under investigation. The aim therefore of the present investigation was: A. To perform an epidemiological study of HCV genotypes in patients with chronic hepatitis C in Crete. Associations among viral genotypes in patients with chronic hepatitis C in Crete. Associations among viral genotypes and disease severity, histological classification, demographic characteristics of patients and viral load were also examined. B. To assess response of patients to various therapeutic regimes. Short and long term biochemical and virological response was assessed and an effort to identity factors influencing treatment response was done through univariate and multivariate analysis. C. Finally mutation in the NS-5A region of HCV genome were examined as possible factors determining the response to interferon treatment in patients infected with the 1b genotype of HCV. Results A. Genotype epidemiology: A1. By a home made nested RT-PCR the presence of HCV RNA was verified in 102 patients with liver biopsy proven chronic hepatitis. A2. Genotypic classification according to Simmonds was performed using reversed immunoblotting (INNO-Lipa, INNOFENETICS, Belgium). A3. Viral load was measured using the Amplicor Monitor System (Roche Diagnostics). A4. The Ishak classification was used for grading and staging of liver biopsies. · Age, sex, serum transaminases, alkaline phosphate, γ-GT, viral load , histological staging and grading were the variables used in univariate and multivariate analysis to look for correlations with genotypes. 64% of patients were infected with genotype 1. Genotype 2 was present in 13%, genotype 3 in 18% and genotype 4 in 5% of patients. Genotypes 5 and 6 were not detected. · Female sex and older age were independent variables related to genotype 1. · Younger age, lower viral loads and high staging were related to genotype 2. · Intravenous drug abuse and higher viral loads were related to genotype 3. · Lower staging and lower viral loads were related to genotype 4. However, only the relation between statistically sign cant mean age of genotype 1 patients was 55,8 years, significantly higher than non - 1 genotypes (p=0,007) B. Treatment response 6 treatment schedules were examined: Group 1 : 30 patients treated for 3 months with 3MU IFN three times a week Group 2 : 35 patients treated for 6 months with 5MU IFN three times a week Group 3 : 60 patients treated for 12 months with 3MU IFN three times a week plus 15mg/kgr ursodeoxycholate (UDCA) Group 4 : 35 patients treated for 6 months with 5MU IFN three times a week plus 500 mg D-Penicillamine. Group 5 : 36 patients treated for 6 months with 5MU IFN three times a week plus 150mg nimesulide Group 6 : 21 patients treated for 12 months with 5MU IFN three times a week plus 1000mg Ribavirin Serum enzymes, viral load and genotyping was performed in all these patients before and after treatment. A liver biopsy before treatment was grated and staged according to Ishak classification. o Short term biochemical response varied between 80% for the D-penicillamine group and 47% for group 1. o Short term virological response varied between 48% for the ribavirin group and 10% for group 1 o Long term biochemical response varied between 33% for the ribavirin group and 14% for groups 1 and 2. o Long term virological response varied between 19% for the ribavirin group and 0% for group 2 Long term biochemical and virological response were generally disappointing. Multivariate analysis showed no relation to treatment response of age, sex, viral load, genotypes or histological grading and staging. C. Sequencing of NS-5A region of 1b genotype: An amplification of the region 6741-7275 of the NS-5A area of 1b genotype was performed by RT-nested PCR in 28 patients infected with this genotype. The PCR product was isolated and purified and then a direct sequencing of nucleotides was done in an automatic sequencer. Results were correlated with response to IFN treatment. Conclusions can be summarized as follows: o Mutated viral clones were very rare in Crete o Wild type clones were different at nucleotide levels form Japanese clones and similar to other reported European clones. o Biochemical response of mutated viruses is favorable and prediction of response can be made from the number of amino acid mutations. By contrast, virological response cannot be predicted.Ο ιός της ηπατίτιδας C (HCV) , αποτελεί την βασική αιτία της χρόνιας ενεργού μορφής της νόσου, η οποία μπορεί να εξελιχθεί σε μεγάλο ποσοστό σε κίρρωση ή ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Τα τελευταία έτη γίνεται προσπάθεια θεραπείας της χρόνιας ενεργού ηπατίτιδας C με την χορήγηση INF-a , ή συνδυασμού με άλλα φάρμακα . Η ανταπόκριση όμως των ασθενών στις διάφορες θεραπείες ποικίλουν και οι παράγοντες που καθορίζουν την ανταπόκριση αμφισβητούνται. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν Α. Επιδημιολογική μελέτη των ασθενούντων λόγω μόλυνσης με τον ιό HCV στην ευρύτερη περιοχή της νήσου Κρήτης. Εξετάσθηκε αν υπάρχει αιτιολογική σύνδεση των διαφόρων γονότυπων του ιού με το είδος της προκαλούμενης ηπατοπάθειας , και προσδιορίσθηκε τη σχέση μεταξύ των γονότυπων του HCV και δημογραφικών, παθολογικών και ιολογικών παραμέτρων σε ασθενείς που έχουν προσβληθεί από τον ιό Β. Θεραπευτικά σχήματα. Ανταπόκριση ασθενών σε θεραπείες. Μελέτη διαφόρων θεραπευτικών σχημάτων , βραχυχρόνιος και μακροχρόνιος , βιοχημική και ιολογική ανταπόκριση των ασθενών σε συνδυασμό φαρμάκων , και προσπάθεια καθορισμού παραγόντων που εξασφαλίζουν την βραχυχρόνια ή μακροχρόνια ανταπόκριση των ασθενών σε ένα συγκεκριμένο θεραπευτικό σχήμα. Γ. Μελέτη των μεταλλαγών της NS-5A περιοχής του ανθεκτικού στην θεραπεία 1b υποτύπου του ιού HCV και η συσχέτιση του αριθμού των μεταλλαγών , με την ανταπόκριση ή όχι στην θεραπεία με INF-a Α. Επιδημιολογική μελέτη του ιού HCV στην Κρήτη. A1. Σε 102 ασθενείς του ηπατολογικού εργαστηρίου του ΠΕ.ΠΑ.Γ.Ν.Η υπόπτους για ηπατίτιδα C με βάση την κλινική τους εικόνα ανιχνεύτηκε RNA του ιού ηπατίτιδας C με μοριακές τεχνικές (home made nested RT-PCR) και επιβεβαιώθηκε η ασθένεια τους. Α2. Για τους παραπάνω ασθενείς έγινε γονιδιακή ταξινόμηση σε υποτύπους με τεχνική αντίστροφου υβριδισμού (INNO-Lipa της INNOGENETICS) Α3. Για τους εν λόγω ασθενείς μετρήθηκε το ιικό φορτίο με εμπορικά διαθέσιμο Kit Amplicor HCV της Roche. Α4. Στους παραπάνω ασθενείς πάρθηκε βιοψία ήπατος , η οποία βαθμονομήθηκε και αξιολογήθηκε με βάση τα κριτήρια Ishak. · Δεδομένα σχετικά με το φύλλο, την ηλικία, τις τρανσαμινάσες, το ιϊκό φορτίο, και τα ιστολογικά δεδομένα πάρθηκαν από κάθε ασθενή και συσχετίστηκαν με πολυπαραγοντική ανάλυση με τον γονότυπο. Στο 64 % των ασθενών είχαν μολυνθεί ανιχνεύτηκε ο γονότυπος 1, 13 % είχαν γονότυπο 2 , 18% είχαν γονότυπο 3 ,ενώ μόνο 5% εμφάνισαν γονότυπο 4. Δεν ανιχνεύσαμε άλλο είδος γονότυπου 5 ή 6 · Μεγαλύτερη ηλικία και οι γυναίκες ήταν ανεξάρτητες μεταβλητές σχετιζόμενες με το γονότυπο 1. · Μικρή ηλικία ,το χαμηλό ιικό φορτίο και το υψηλό staging σχετίστηκαν με το γονότυπο 2. · Ιστορικό ή χρήστες ναρκωτικών και υψηλή ιαιμία συσχετίστηκαν με γονότυπο 3. · Χαμηλό staging και χαμηλή ιαιμία για γονότυπο 4. Στατιστικά σημαντική ήταν μόνο η σχέση ηλικίας και γονοτύπου. Οι ασθενείς με γονότυπο 1 είχαν μέση ηλικία 55,8 σημαντικά μεγαλύτερη από τους μη-1 γονότυπους (p=0.007) Β. Θεραπευτικά σχήματα. Ανταπόκριση ασθενών σε θεραπείες. Μετά από διαγνωσμένη με PCR ηπατίτιδα C, στην Γαστρεντερολογική κλινική του ΠΕ.ΠΑ.Γ.Ν.Η δημιουργήθηκαν οι παρακάτω ομάδες: 1. 30 ασθενείς υποβλήθηκαν σε 3μηνη θεραπεία με 3 MU INF-2a. 2. 35 ασθενείς υποβλήθηκαν σε 6μηνη θεραπεία με 5 MU INF-2a. 3. 60 ασθενείς υποβλήθηκαν σε 12μηνη θεραπεία με 3 MU INF-2a + UDCA. 4. 35 ασθενείς υποβλήθηκαν σε 6μηνη θεραπεία με 5 MU INF-2a + D Penicillamine. 5. 36 ασθενείς υποβλήθηκαν σε 6μηνη θεραπεία με 5 MU INF-2a + νιμεσουλίδη 6. 21 ασθενείς υποβλήθηκαν σε 12μηνη θεραπεία με INF-2a + Ριμπαβιρίνη. Για όλους τους παραπάνω μετρήθηκαν τρανσαμινάσες , ιικό φορτίο πριν και μετά την θεραπεία. Ταξινομήθηκαν γονιδιακά σε υποτύπους και υποβλήθηκαν σε βιοψία η οποία βαθμονομήθηκε κατά Ishak. Τα συμπεράσματα συνοψίζονται στα εξής · Οι βραχυχρόνιες βιοχημικές ανταποκρίσεις κυμαίνονται από 80% για την ομάδα με 5 MU INF-2a + D Penycilamin έως 47% για την ομάδα με 3μηνη θεραπεία με 3 MU INF-2a. · Οι βραχυχρόνιες ιολογικές ανταποκρίσεις κυμαίνονται από 48% για την ομάδα με 3 MU INF-2a + rivabirin, έως 10% για την ομάδα με 3μηνη θεραπεία με 3 MU INF-2a. · Οι μακροχρόνιες βιοχημικές ανταποκρίσεις κυμαίνονται από 33% για την ομάδα με INF-2a + Ριβαμπιρίνη έως 14% για τις ομάδες με 3μηνη θεραπεία με 3 MU INF-2a και 6μηνη με 5 MU INF-2a. · Οι μακροχρόνιες ιολογικές ανταποκρίσεις κυμαίνονται από 19% για την ομάδα με INF-2a + Ριβαμπιρίνη έως 0% για την ομάδα 6μηνη θεραπεία με 5 MU INF-2a. Γενικώς η μακροχρόνιος βιοχημική και ιολογική ανταπόκριση ήταν απογοητευτική. Η πολυπαραγοντική ανάλυση δεν έδειξε συσχέτιση της μακροχρόνιας ανταπόκρισης με το φύλο , ηλικία , ιικό φορτίο , γονότυπο ή ιστολογικές παραμέτρους των ασθενών. Γ. Ανάγνωση των αλληλουχιών της NS-5A περιοχής του1b υποτύπου (sequencing NS-5A region)και συσχέτηση με την ανταπόκριση στην INF-2a Σε 28 ασθενείς με 1b υπότυπο ενισχύθηκε η NS-5A περιοχή (6741-7275) με RT-nested PCR, απομονώθηκε και καθαρίστηκε το PCR προϊόν και ακολούθως έγινε απ' ευθείας διάβασμα της αλληλουχίας σε αυτόματο sequencer ALF-Express Pharmacia. Τα αποτελέσματα συσχετίστηκαν με την ανταπόκριση σε θεραπεία με INF-2a. Τα συμπεράσματα συνοψίζονται στα εξής · Τα μεταλλαγμένα στελέχη είναι πολύ σπάνια στο υλικό μας. · Τα αρχέγονα (wild type) στελέχη είναι διαφορετικά σε επίπεδο νουκλεοτιδίων από τα Ιαπωνικά και όμοια με τα Ευρωπαϊκά · Η βιοχημική ανταπόκριση των μεταλλαγμένων στελεχών είναι ευνοϊκή και μπορεί να προβλεφθεί από τον αριθμό των αμινοξικών μεταλλαγών .Αντιθέτως η ιολογική ανταπόκριση δεν μπορεί να προβλεφθεί