Μελέτη της ανάπτυξης του τραχειακού συστήματος της Drosophila melanogaster

Τα επιθήλια αποτελούν σημαντικές δομικές αλλά και λειτουργικές μονάδες πολυάριθμων ιστών. Συμμετέχουν στο σχηματισμό των περισσότερων, αν όχι όλων των οργάνων και είναι σημαντικά για τη αλληλεπίδραση τους με τους γειτονικούς ιστούς και το περιβάλλον. Εμπλέκονται σε διάφορες φυσιολογικές διεργασίες όπως την πρόσληψη θρεπτικών συστατικών και το φιλτράρισμα του αίματος. Παράλληλα, προστατεύουν τον οργανισμό από τη εισβολή εξωγενών παθογόνων και λειτουργούν ως φραγμοί διαπερατότητας περιορίζοντας την ελεύθερη διάχυση νερού και διαλυτών. Το αναπνευστικό σύστημα των εντόμων αποτελείται από ένα περίπλοκο δίκτυο επιθηλιακών αγωγών (την τραχεία και τα αναπνευστικά στόμια) που μεταφέρουν οξυγόνο μέσω του αέρα σε όλα τα επιμέρους όργανα. Αναπτύσσεται κατά την εμβρυογένεση και γίνεται λειτουργικό κατά την εκκόλαψη της προνύμφης. Οι αεραγωγοί και τα αναπνευστικά στόμια της Drosophila melanogaster έχουν μελετηθεί εκτενώς καθώς αποτελούν αντιπροσωπευτικό μοντέλο για την κατανόηση της ανάπτυξης, της ωρίμανσης και της λειτουργίας των επιθηλιακών σωληνοειδών οργάνων. Σε μια προσπάθεια εντοπισμού νέων γονιδίων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την ωρίμανση του αναπνευστικού συστήματος της Drosophila και ειδικότερα στο σχηματισμό του φραγμού διαπερατότητας του τραχειακού επιθηλίου, πραγματοποιήθηκε γενετική διαλογή διαφόρων μεταλλαγμένων στελεχών. Η συγκεκριμένη προσέγγιση οδήγησε στην ταυτοποίηση του γονιδίου Btk29A ως σημαντικό για τη μορφογένεση των οπίσθιων αναπνευστικών στομίων, τη λειτουργία του τραχειακού φραγμού διαπερατότητας και την ωρίμανση του τραχειακού συστήματος. Το γονίδιο Btk29A κωδικοποιεί για μια κινάση τυροσίνης, της οικογένειας των Tec κινασών, η οποία είναι συντηρημένη τόσο στα σπονδυλωτά , όσο και στα ασπόνδυλα. Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η αποσαφήνιση του ρόλου του Btk29A στην ανάπτυξη του αναπνευστικού συστήματος της Drosophila. Ανάλυση του προτύπου έκφρασης του γονιδίου Btk29A με πειράματα in situ υβριδοποίησης και ανοσοϊστοχημικές χρώσεις, με χρήση νέου πολυκλωνικού αντισώματος για την πρωτεΐνη Btk29A, που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο στα πλαίσια της παρούσας μελέτης, αποκάλυψε πως το γονίδιο εκφράζεται στα κύτταρα του τραχειακού συστήματος και των οπίσθιων αναπνευστικών στομίων. Η έκφραση του Btk29A στους συγκεκριμένους ιστούς ξεκινά στο εμβρυικό στάδιο 11 και διατηρείται μέχρι και το τέλος της εμβρυογένεσης. Παράλληλα αποκαλύφθηκε πως μονάχα η μια από τις δυο ισομορφές της πρωτεΐνης Btk29A, η Τύπου 1 (ή Κοντή) ισομορφή, εκφράζεται από τα κύτταρα του αναπνευστικού συστήματος, ενώ η Τύπου 2 (ή Μακριά) ισομορφή εντοπίζεται μονάχα στα κύτταρα του κεντρικού νευρικού συστήματος. 1 Τα οπίσθια αναπνευστικά στόμια της Drosophila συνδέουν το τραχειακό σύστημα με το περιβάλλον. Αποτελούνται εσωτερικά από τον αναπνευστικό θάλαμο (spiracular chamber), ένα σωληνοειδή ιστό, συνεχή του τραχειακού σωλήνα, και εξωτερικά από το στιγματοφόρο (stigmatophore), μια εκτενή επιδερμική δομή που περιβάλλει τον αναπνευστικό θάλαμο. Ο ιστός αναπτύσσεται από μια ομάδα επιθηλιακών κυττάρων εκτοδερμικής προέλευσης μέσα από ποικίλες μορφογενετικές αλλαγές. Στο τέλος της εμβρυογένεσης, τα συγκεκριμένα κύτταρα ολοκληρώνουν τοπολογικές αναδιατάξεις σχηματίζοντας τα τρισδιάστατα οπίσθια αναπνευστικά στόμια. Τόσο τα κύτταρα του αναπνευστικού θαλάμου, όσο και τα κύτταρα του στιγματοφόρου εκφράζουν Btk29A. Σε ομόζυγα μεταλλαγμένα έμβρυα για το Btk29A, τα οπίσθια αναπνευστικά στόμια είναι κοντύτερα από αυτά των αγρίου τύπου εμβρύων και εμφανίζουν μη φυσιολογικό σχήμα. Παρατήρηση της ανάπτυξης των οπίσθιων αναπνευστικών στομίων ζωντανών εμβρύων, με in vivo μικροσκοπία, αποκάλυψε πως τα κύτταρα του αναπνευστικού θαλάμου δεν ολοκληρώνουν τη διαδικασία εγκόλπωσης που είναι αναγκαία για τη μορφογένεσή του ιστού, με τα πιο οπίσθια αυτών να παραμένουν στην επιφάνεια. Για την καλύτερη ανάλυση του φαινοτύπου, εξετάσθηκαν παράμετροι που εμπλέκονται στη ρύθμιση της εγκόλπωσης των κυττάρων του αναπνευστικού θαλάμου, όπως: η διαδικασία σύσφιξης της κορυφαίας μεμβράνης (apical constriction), οι αλλαγές στο σχήμα των κυττάρων, η οργάνωση του κυτταροσκελετικού δικτύου της ακτίνης και της μυοσίνης και η ενεργότητα της Rho1 GTPase. Καμία από τις παραπάνω παραμέτρους δεν επηρεάζεται σε ομόζυγα μεταλλαγμένα έμβρυα για το Btk29A. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα διάσωσης φαινοτύπου βασισμένα στην ιστοειδική έκφραση του γονιδίου Btk29A με χρήση του συστήματος UAS-GAL4. Τα συγκεκριμένα πειράματα έδειξαν πως η επαναφορά της έκφρασης της Btk29A στα κύτταρα του αναπνευστικού θαλάμου δε διασώζει την ανώμαλη μορφογένεση των οπίσθιων αναπνευστικών στομίων. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός πως ο φαινότυπος διασώζεται με επαναφορά της έκφρασης της Btk29A στα κύτταρα του στιγματοφόρου. Τα παραπάνω αποτελέσματα προτείνουν πως η εγκόλπωση των κυττάρων του αναπνευστικού θαλάμου είναι πιθανό να ρυθμίζεται μέσω κυτταρικά μη αυτόνομης (non-cell autonomous) δράσης της Btk29A στα κύτταρα του στιγματοφόρου. Παρατήρηση των μορφογενετικών κινήσεων των κυττάρων του στιγματοφόρου ζωντανών εμβρύων, με in vivo μικροσκοπία, αποκάλυψε πως η Btk29A είναι σημαντική για τις τοπολογικές ανακατατάξεις των κυττάρων του στιγματοφόρου. Επιπρόσθετα, αποκάλυψε πως η σωστή ρύθμιση αυτών των ανακατατάξεων είναι σημαντική για τη φυσιολογική τοποθέτηση των γειτονικών κυττάρων του αναπνευστικού θαλάμου και την ολοκλήρωση της εγκόλπωσης τους. Συνολικά, η παρούσα μελέτη προτείνει πως η κινάση τυροσίνης Btk29A, της οποίας η έκφραση στα οπίσθια αναπνευστικά στόμια ρυθμίζεται από το μεταγραφικό παράγοντα Abdominal-B, επηρεάζει τη μορφογένεση του συγκεκριμένου ιστού με δύο διακριτούς τρόπους. Πρωτίστως, 2 ρυθμίζει τις τοπολογικές ανακατατάξεις των κυττάρων του στιγματοφόρου δρώντας κυτταρικά αυτόνομα (cell autonomously) στα κύτταρα αυτά. Δευτερευόντως, η Btk29A εξασφαλίζει, δρώντας κυτταρικά μη αυτόνομα (non-cell autonomously), την αποτελεσματική εγκόλπωση των κυττάρων του αναπνευστικού θαλάμου. Πέραν του μη φυσιολογικού σχηματισμού των οπίσθιων αναπνευστικών στομίων, το αναπνευστικό σύστημα των ομόζυγα μεταλλαγμένων Btk29A στελεχών χαρακτηρίζεται και από διατάραξη του φραγμού διαπερατότητας του τραχειακού επιθηλίου και μη ολοκλήρωση της ωρίμανσης του κατά το τέλος της εμβρυογένεσης. Η συνολική μορφολογία της τραχείας δεν επηρεάζεται: οι αεραγωγοί εμφανίζουν φυσιολογικό μέγεθος, σχηματισμό των διακλαδώσεων και η χιτίνη εναποτίθεται φυσιολογικά στο εσωτερικό του τραχειακού αυλού. Για την κατανόηση της εμπλοκής της Btk29A στη διατάραξη του επιθηλιακού φραγμού διαπερατότητας της τραχείας εξετάσθηκε η δομή και η μοριακή σύσταση συγκεκριμένων διακυτταρικών συνδέσεων, των Διαφραγματικών Συνδέσεων (septate junctions, SJs), που είναι σημαντικές για το σχηματισμό και τη διατήρηση των επιθηλιακών φραγμών διαπερατότητας στη Drosophila. Ανάλυση των διαφραγματικών συνδέσεων που αναπτύσσονται μεταξύ των κυττάρων της τραχείας δεν αποκάλυψε ανωμαλία στη δομή και τον εντοπισμό των πρωτεϊνικών μορίων που τις συνιστούν. Κατά συνέπεια, η διατάραξη του επιθηλιακού φραγμού διαπερατότητας δεν είναι αποτέλεσμα μη φυσιολογικού σχηματισμού ή διατήρησης των Διαφραγματικών Συνδέσεων. Συνοψίζοντας, η παρούσα μελέτη προσφέρει νέες πληροφορίες για τη δράση της κινάσης Btk29A στην ανάπτυξη και ωρίμανση του αναπνευστικού συστήματος της Drosophila melanogaster. Ειδικότερα, επισημαίνει τη σημασία των πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσονται μεταξύ των οργάνων κατά τη μορφογένεση για τη σωστή ανάπτυξη και λειτουργία των οργάνων.Epithelia are key building blocks of many organs. They play important roles from both a structural and functional point of view. Epithelia line most if not all organs and they can play important roles in the interactions with the surrounding environment and nearby tissues. Transport properties of epithelia are key to many physiological functions in a multicellular organism, like nutrient uptake and blood filtering. Epithelia also protect the body from the invasion of external pathogens. Finally, they work as permeability barriers and limit the free diffusion of water and solutes, allowing the establishment and maintenance of specific intra-organ and luminal milieu across the two sides of the epithelium. The respiratory system of insects is a vital organ primarily consisting of a complex network of epithelial tubes (the trachea and spiracles) that deliver air-borne oxygen to all organs. It develops in the embryo and becomes functional as the embryo hatches to become a crawling larva. In particular the airways and spiracles of Drosophila melanogaster have long been studied as a tractable model to understand the development, maturation and function of epithelial tubular organs. A genetic screen had been conducted in our laboratory to identify new candidate genes involved in the development and maturation of the fly respiratory system, and in particular the establishment of the permeability barrier of the tracheal epithelium. This screen led to the identification of Btk29A as a gene essential for spiracle morphogenesis, tracheal barrier function and airways maturation. Btk29A encodes for a non-receptor tyrosine kinase, a member of the Tec family of tyrosine kinases, conserved across vertebrates and invertebrates. The aim of this study was to unravel the role of Btk29A in the formation of the respiratory system. Analysis of Btk29A expression pattern with in situ hybridization and antibody staining (using a newly developed polyclonal Btk29A antibody) enabled the documentation of the expression in the trachea and posterior spiracles. Btk29A expression is detected in both tissues from embryonic stage 11 till late embryogenesis. Interestingly, in the embryo only one of the two Btk29A isoforms, the Short (or Type 1) isoform, is expressed by the cells of the respiratory system, while the Long (or Type 2) isoform appears solely in the cells of the central nervous system. The posterior spiracles of Drosophila connect the tracheal tubes to the environment. They consist internally of the spiracular chamber, an invaginated tube with filtering properties that is continuous to the trachea and externally of the stigmatophore, an extensible epidermal structure that covers the spiracular chamber. The tissue develops from a two-dimensional group of ectoderm- 4 derived epithelial cells and involves multiple morphogenetic steps. In the end of embryogenesis the cells have rearranged their positions to form three-dimensional tubular structures. Both of the posterior spiracle compartments express Btk29A. The spiracles of Btk29A mutant embryos are shorter and display abnormal shape. In vivo imaging of the posterior spiracle morphogenesis in Btk29A mutants revealed that although the invagination process is not completely abolished, the most distal of the spiracular chamber cells fail to invaginate. In order to explain the phenotype, several parameters known to affect the fine-tuning of spiracular chamber invagination were examined: apical constriction, cell shape changes, organization of actin-myosin network and activation of the Rho1 GTPase. None of these parameters seems impaired in Btk29A mutants. In parallel, phenotypic rescue experiments, using different tissue specific GAL4 drivers, showed that recovery of Btk29A expression by the spiracular chamber cells is not sufficient to rescue the invagination phenotype. Interestingly the recovery of the kinase in the stigmatophore cells led to normally shaped posterior spiracles. The above suggests that Btk29A might regulate spiracular chamber cell invagination through stigmatophore cells in a non-cell autonomous manner. In vivo imaging of the morphogenetic movements of the stigmatophore cells further showed that Btk29A is indeed important for the regulation of the spatial rearrangements of the stigmatophore cells. Additionally, it revealed that the positioning of the spiracular chamber cells and the execution of their invagination program is highly dependent on the extent of stigmatophore cell rearrangements. Overall, it seems that Btk29A, acting downstream of the spiracle master regulator Abdominal-B, affects spiracle morphogenesis in two distinct ways: first it cell-autonomously controls the convergent extension of stigmatophore cells; second, Btk29A ensures, non-cell autonomously, the efficient invagination of spiracular chamber cells. The respiratory system of Btk29A mutant embryos is additionally characterised by a leaky tracheal permeability barrier and a failure to fill with air at the end of embryogenesis. The overall trachea morphology is not affected: the airways have normal size, branch patterning and chitin deposition in the tracheal lumen. In order to understand the cause of the permeability barrier defect, specific intercellular junctions, the Septate Junctions (SJs) were examined. These junctions are crucial for the establishment of the epithelial permeability barriers in Drosophila. The ultrastructure of the SJs, as well as the subcellular localization of the SJ proteins, is not impaired in the tracheal cells of Btk29A mutants. It is thus likely that the permeability phenotype is not due to gross impairment in SJ formation or maintenance. 5 In conclusion the work undertaken during my doctoral studies offers insights into the role of Btk29A kinase in the development and maturation of the Drosophila respiratory system. In particular my work has highlighted the complex physical interactions that take place among organ components during morphogenesis, which contribute to their final form and function