Desenvolvimento e validação de metodologias analíticas confirmatórias para análise de substâncias psicoativas em trânsito

A cocaína (COC) é um alcaloide presente nas folhas de espécies do gênero Erytroxylum novagranatense e Erytroxylum coca. Possui grande efeito estimulante sobre o Sistema Nervoso Central (SNC) e por isso é utilizada como droga de abuso. Dentre os principais metabólitos estão a benzoilecgonina (BZE), éster metil anidroecgonina (EMA) e anidroegonina (AEC), sendo que os dois últimos são provenientes de pirólise (consumo do crack através do fumo ou inalação). Ainda, o cocaetileno (CE) é biotransformado após a ingestão conjunta de COC e etanol. O consumo de substâncias psicoativas (SPA), dentre elas a COC e seus derivados, traz diversos prejuízos à saúde dos usuários, principalmente quando se considera a interação causada pelos compostos adulterantes, adicionados à droga para aumentar lucros e mimetizar os efeitos desejados. Ainda, o uso associado ao trânsito, é uma preocupação crescente em toda a sociedade, pois eleva em números consideráveis a chance da ocorrência de acidentes de trânsito. A detecção de SPA pode ser feita em uma variedade de matrizes biológicas, sendo que cada uma possui suas particularidades, incluindo diferentes janelas de detecção. Análises realizadas em fluido oral (FO), urina e sangue são recomendadas por guias nacionais e internacionais para a detecção de SPA e se complementam pois identificam as drogas intactas e seus produtos de biotransformação em diferentes concentrações e períodos de tempo. A correlação de concentração entre essas matrizes não é bem estabelecida, sendo que diversos estudos reportados na literatura trazem resultados controversos. A validação de métodos analíticos ou bioanalíticos é etapa crucial para a realização de análises seguras e que não deixem margem de dúvida na interpretação dos resultados, caracterizando-se como de extrema importância em todas as áreas da toxicologia. Nesse sentido, foram desenvolvidos e validados métodos para a detecção simultânea de COC, BZE, CE, EMA e AEC em FO, urina e plasma, utilizando cromatografia líquida acoplada a detector de massas (CL-EM), além de três métodos para análise de COC e compostos adulterantes em amostras de apreensão, sendo dois deles qualitativos, utilizando cromatografia gasosa acoplada à detector de massas (CG-EM) e cromatografia gasosa portátil acoplada à detector de massas íon trap (CG-EM-IT) e um quantitativo utilizando cromatografia líquida acoplada à detector de massas sequencial (CL-EM/EM). Ainda, um estudo de correlação foi aplicado a fim de avaliar a concentração dos metabólitos entre as matrizes biológicas coletadas simultaneamente. As etapas de preparação das amostras nos métodos bioanalíticos compreenderam precipitação de proteínas com acetonitrila, seguida de filtração para urina e plasma e diluição em tampão seguida de filtração para FO. As curvas de calibração foram lineares entre 4,25 e 544,00 ng/mL para FO, e entre 5,00 e 320,00 ng/mL para urina e plasma. Os limites inferiores de quantificação foram iguais à menor concentração das curvas de calibração. Os limites de precisão e exatidão intra e inter-dias mantiveram-se dentro dos limites de ±20% para o limite de quantificação e ±15% para os demais controles preconizados pelas guias regulatórias. Os métodos desenvolvidos foram aplicados satisfatoriamente em 110, 116 e 113 amostras de FO, urina e plasma, respectivamente, coletadas de usuários de múltiplas drogas. Os resultados mostraram alta prevalência destes analitos nesta população, especialmente COC e BZE, presentes em 75,8 e 75,0% dos casos, respectivamente. Em relação ao método analítico quantitativo, este se mostrou preciso, exato e linear na faixa de 50 – 2000 ng/mL, todos os demais parâmetros se mantiveram dentro dos limites preconizados. Levamisol (LEV), fenacetina (FEN), cafeína (CAF), hidroxizina (HDZ) e benzocaína (BZC) foram os adulterantes mais encontrados dentre as 166 amostras de apreensão analisadas. O método qualitativo por CG-EM foi efetivo para ser utilizado como método de screening para todos os compostos, equanto que o método por CG-EM-IT apresentou restrições de aplicação para alguns compostos. Os capítulos apresentados nesse trabalho abrangem de uma maneira geral a análise de COC e seus derivados em amostras biológicas e material apreendido, assim como trazem uma abordagem em relação aos problemas relacionados ao uso e tráfico de drogas em diferentes cenários. Os métodos desenvolvidos neste trabalho podem ser aplicados, além da área de trânsito e controle de materias apreendidos, em diferentes áreas de conhecimento como laboratórios de toxicologia clínica, forense e no próprio meio científico.Cocaine (COC) is an alkaloid which is found in the leaves of Erytroxylum novagranaense and Erytroxylum coca. COC has a strong stimulant effect on central nervous system (CNS) and this is the reason for its classification as drug of abuse. Benzoylecgonine (BZE), anhydroecgonine methyl ester (AEME) and anhydroecgonine (AEC) are among its main metabolites. AEME and AEC are pyrolysis products that forms as a result of crack-cocaine consumption through smoking or inhalation. Additionally, cocaethylene (CE) is biotransformed after the ingestion of cocaine and alcohol. The use of psychoactive substances (SP), including cocaine and its derivatives, can cause several issues to the health of its users specially when the interactions caused by cutting agents added to the drugs to increase the profits and mimic the effects are taken into consideration. Furthermore, the use of SP combined with driving is an emerging problem since it increases the chances of traffic accidents. The detection of SP can be done in a variety of biological matrices that each has their own particularities such as different windows of detection. The guidelines recommend analysis in oral fluid (OF), urine, and blood for the detection of SP. These three matrices complement each other because it is possible to identify drugs and the products of biotransformation in varying concentrations and periods of time. The coefficient of correlation between those three matrices is not very well established since many studies report conflicting results. The validation of analytical or bioanalytical methods is an important step to ensure accurate results and it is considered essential in every area of toxicology. Therefore, methods for the detection of COC, BZE, AEME, AEC and CE in OF, urine and plasma were developed and validated using liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS). Likewise, three methods (two qualitative and one quantitative) for the detection of COC and known cutting agents in seized drugs were developed using gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), portable gas chromatography toroidal ion trap mass spectrometry (GC-TMS), and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). A correlation study was done to evaluate the drug concentrations in the three matrices collected simultaneously. OF was diluted in buffer while urine and plasma were precipitated using acetonitrile. Calibration curve ranges were prepared at 4.25 – 544 ng/mL for oral fluid, and 5 – 320 ng/mL for urine and plasma. The lowest concentration of the calibration curves were designated as the lower limit of quantification. The calculated precision and accuracy values were within the limits stipulated by the guidelines (±20% for the limit of quantification and ±15% for the rest of the quality controls). The methods were fully validated and proved to be suitable for analysis of 110, 116, and 113 samples of OF, urine, and plasma, respectively, that were collected from drug users. The results showed high prevalence of SP drugs in this population. Particularly of note, COC and BZE were found in 75.8 and 75.0% of the cases, respectively. The analytical quantitative method proved to be precise, accurate, and linear in the range of 50 – 2000 ng/mL; all the other parameters were within the limits stipulated. Levamisole (LEV), phenacetin (PHN), caffeine (CAF), hydroxyzine (HYDZ), and benzocaine (BZC) were the adulterants most prevalent in the 166 samples analyzed. The analytical qualitative method by GC-MS was shown to be effective as screening method for all the compounds, while the analytical method by GC-TMS was limited due to its incompatibility with certain target compounds. The chapters presented in this work comprise the analysis of cocaine and its derivatives in biological matrices and seized material, as well as an approach relating to the analysis of samples from impaired driving and similar scenarios. The methods developed in this work can be further applied to other areas of science and research including clinical toxicology, general laboratories and forensic laboratories