Molecular and immunological characterisation and regulation of arginine decarboxylase from grapevine (Vitis vinifera L.)

Polyamines spermidine and spermine and their obligatory precursor, putrescine, are small aliphatic amines, ubiquitous in living organisms. Even though their exact role and function is not yet understood, many studies relate them with various physiological procedures, including cellular development and differentiation to stress-induced responses. The preliminary and determinant stage of polyamine biosynthesis is the decarboxylation of ornithine and arginine from the homonymous decarboxylases, to putrescine and agmatine, respectively. In the present study, the regulation of polyamine biosynthesis from arginine decarboxylase (ADC) was examined. This was done in a woody perennial plant species, the grapevine (Vitis vinifera L.), which does not respond to in vitro morphogenetic manipulations. The optimum pH and temperature for grapevine enzyme were 8.0 and 37 oC, respectively. Grapevine ADC demanded the presence of soylfhydryl-groups and pyridoxal phosphate in order to exhibit maximum activity but there was no dependence on any metal factor. Agmatine and putrescine inhibited enzyme activity in relatively high concentrations. ADC activity was high in tissues with high metabolic activity and low in roots. In grapevine seedlings, ADC activity was high at the early stages of germination and was reduced later, similar to suspension cultures and calluses immediately after subculture. The deduced amino acid sequence of an isolated ADC cDNA clone (EMBL, accession no X96791) consists of 630 amino acid residues (about 100 amino acids are missing from the N-terminal) and includes the characteristic patterns of group IV of ornithine/ Dap/ arginine decarboxylases. The clone exhibits 70-75 % identity with other dicot ADCs, 40 % identity with the monocot oat ADC and 30 % identity with bacterial ADCs. Southern blot analysis supports the presence of a single ADC gene in grapevine genome. Northern analysis of total RNA from different grapevine tissues indicates that grapevine ADC gene is expressed as a single transcript of approximately 3,1 kb with a tissue specific expression pattern. The addition of ammonium ion and glutamine to grapevine cell suspension cultures increased the in vitro ADC activity to a larger extent than the addition of arginine and glutamate. On the contrary, ADC activity was not affected by the addition of nitrates whereas it was reduced by the addition of putrescine. The changes in ADC activity were not accompanied by analogous changes in the ADC transcript levels. The endogenous free putrescine and arginine titers followed the changes in ADC activity. Antibody prepared against ADC detected a protein band of about 80 kDa in size, in total protein extracts from different grapevine tissues. Protein extracts from leaves and shoots in different developmental stages, presented differences in the quantity of the 80-kDa band, but these differences did not follow the changes in ADC specific activity. Furthermore, protein extracts from cell suspension cultures treated with ammonium or nitrate ions or putrescine, with pronounced differences in ADC specific activity, did not show equivalent quantitative differences in the 80-kDa protein band. From the above results it is concluded that changes in ADC activity are not due to induction or suppression of its gene. Therefore, ADC regulation in grapevine is post-transcriptional and possibly post-translational as for other enzymes of polyamine biosynthesis in plants and other kingdoms.Οι πολυαμίνες σπερμιδίνη και σπερμίνη και ο υποχρεωτικός πρόδρομός τους, η πουτρεσκίνη, είναι μικρές αλειφατικές αμίνες που βρίσκονται σε όλα τα κύτταρα. Αν και ο ακριβής ρόλος τους και ο τρόπος δράσης τους δεν έχει, ακόμα, γίνει κατανοητός, πολυάριθμες μελέτες τις συνδέουν με ποικίλες φυσιολογικές διαδικασίες, που περιλαμβάνουν από την κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση έως και την απόκριση σε συνθήκες καταπόνησης. Το αρχικό και καθοριστικό στάδιο της βιοσύνθεσης των πολυαμινών είναι η αποκαρβοξυλίωση της ορνιθίνης και της αργινίνης από τις ομώνυμες αποκαρβοξυλάσες, προς πουτρεσκίνη και αγματίνη, αντίστοιχα. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ρύθμιση της βιοσύνθεσής των πολυαμινών από την αποκαρβοξυλάση της αργινίνης (ADC), σε ένα πολυετές φυτικό είδος, την άμπελο (Vitis vinifera L.), το οποίο δεν αποκρίνεται σε in vitro μορφογενετικούς χειρισμούς. Η ADC της αμπέλου έχει άριστο pH στο 8,0, άριστο θερμοκρασίας στους 37 οC, απαιτεί την παρουσία σουλφυδρυλομάδων και φωσφορικής πυριδοξάλης αλλά όχι κάποιου μεταλλικού παράγοντα για την επίδειξη του μέγιστου της ενεργότητάς της και η αγματίνη και η πουτρεσκίνη παρεμποδίζουν την ενεργότητα της σε μεγάλες, σχετικά, συγκεντρώσεις. Η ενεργότητα της ήταν υψηλότερη στους μεταβολικά ενεργότερους ιστούς ενώ στις ρίζες ήταν η χαμηλότερη. Σε σπορόφυτα της αμπέλου η ενεργότητα της ADC ήταν μεγαλύτερη με την έναρξη του φυτρώματος και μειωνόταν με το χρόνο όπως συνέβαινε και στις κυτταροκαλλιέργειες και στους κάλλους αμέσως μετά την υποκαλλιέργεια. Η αμινοξική αλληλουχία ενός cDNA κλώνου της ADC που απομονώθηκε (EMBL, accession no X96791) αποτελείται από 630 αμινοξέα (λείπουν περίπου 100 αμινοξέα από το αμινοτελικό άκρο), φέρει τα χαρακτηριστικά πρότυπα της ομάδας ΙV των αποκαρβοξυλασών της Ορνιθίνης/ Dap/ Αργινίνης και εμφανίζει ταυτότητα 70-75% με τις αλληλουχίες της ADC των δικοτυλήδονων, 40% με την ADC της βρώμης και 30% με τις βακτηριακές ADCs. Ανάλυση κατά Southern έδειξε την ύπαρξη ενός γονιδίου ομόλογου με το cDNA που απομονώθηκε ενώ σε ανάλυση northern ολικού RNA από διάφορους ιστούς της αμπέλου εντοπίσθηκε ένα μετάγραφο, μεγέθους περίπου 3,1 kb, με διαφορετικό πρότυπο έκφρασης. Η in vitro ενεργότητα της ADC σε κυτταροκαλλιέργειες, αυξήθηκε με την προσθήκη αμμωνιακών και γλουταμίνης περισσότερο από ότι με την προσθήκη αργινίνης και γλουταμικού, δεν επηρεάσθηκε από τα νιτρικά, ενώ μειώθηκε με την πουτρεσκίνη. Ανάλυση northern έδειξε ότι καμία από τις παραπάνω επεμβάσεις δεν προκάλεσε αλλαγές στην ποσότητα του mRNA της. Αντίθετα, τα επίπεδα της ενδογενούς ελεύθερης πουτρεσκίνης και αργινίνης ακολούθησαν τις αλλαγές στην ενεργότητα της ADC. Αντίσωμα, που παρασκευάσθηκε εναντίον της ADC, αναγνωρίζει σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από διάφορους ιστούς κυρίως μία πρωτεϊνική ζώνη μεγέθους περίπου 80 kDa. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από φύλλα και βλαστούς αμπέλου, σε διαφορετικά οντογενετικά στάδια, παρουσίασαν διαφορές στην ποσότητα της πρωτεϊνικής ζώνης των 80 kDa χωρίς όμως οι διαφορές αυτές να ακολουθούν τις αλλαγές στην ειδική ενεργότητα της ADC. Επίσης, σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα κυτταροκαλλιεργειών, με μεγάλες διαφορές στην ενεργότητα της ADC, δεν ανιχνεύθηκαν ποσοτικές διαφορές στην πρωτεϊνική ζώνη των 80 kDa που να συμβαδίζουν με αυτές. Από τα παραπάνω φαίνεται ότι οι αλλαγές στην ενεργότητα της ADC δεν οφείλονται σε επαγωγή ή καταστολή του γονιδίου της και επομένως η ρύθμιση της στην άμπελο γίνεται μετα-μεταγραφικά και πιθανώς μετα-μεταφραστικά όπως συμβαίνει και με άλλα ένζυμα της βιοσύνθεσης των πολυαμινών