Influence of antimicrobial administration in feed of pigs raised with different medication levels on the Escherichia coli resistance and on the gut microbiota profile

Bactérias resistentes aos antimicrobianos representam um risco, não apenas para a saúde animal, como também para a saúde pública. As bactérias comensais, como Escherichia coli, são consideradas um bom indicador do padrão de resistência de uma população microbiana, uma vez que, por residirem no intestino, estão submetidas à constante pressão de seleção resultante da administração de antimicrobianos, podendo sobreviver ao processo de abate de suínos e chegar aos consumidores. Neste sentido, os objetivos deste estudo foram: i. avaliar a frequência de resistência antimicrobiana fenotípica e a presença de grupos clonais em E. coli isoladas de fezes e carcaças suínas; ii. determinar o perfil fenotípico e genotípico de resistência aos antimicrobianos em isolados multirresistentes de E. coli provenientes de carcaças de suínos e identificar grupos clonais presentes em carcaças suínas; iii. comparar o perfil fenotípico de resistência antimicrobiana em isolados de E. coli de fezes de suínos submetidos a diferentes protocolos de administração de antimicrobianos via ração; iv. descrever o perfil da microbiota intestinal de suínos submetidos a diferentes protocolos de uso de antimicrobianos via ração. Para isto, três etapas distintas foram realizadas. Na etapa 1, dois ciclos de amostragem foram conduzidos em três matadouros-frigoríficos (A, B, C) de suínos, sendo coletado fezes depositadas no piso da pocilga de espera e suabes de superfície de carcaças na etapa de pré-resfriamento. Escherichia coli foi isolada dessas duas origens e avaliada quanto à resistência aos antimicrobianos. Além disso, 92 isolados de ambas as origens apresentando perfil de multirresistência foram submetidos à análise por Pulsed-field gel eletrophoresis (PFGE). Para a etapa 2, os isolados multirresistentes provenientes de carcaças foram submetidos a novos testes de sensibilidade antimicrobiana e de acordo com o perfil fenotípico foram pesquisados quanto aos genes de resistências e submetidos à técnica de PFGE. Em relação a etapa 3, quatro grupos de suínos que utilizavam protocolos distintos de uso de antimicrobianos via ração foram acompanhados em todas as fases zootécnicas e avaliados quanto a frequência de resistência antimicrobiana de E. coli e perfil bacteriano da microbiota intestinal através do sequenciamento de duas regiões do gene 16S rRNA. Entre os 674 isolados de E. coli da etapa 1 apenas 7,4% foram susceptíveis a todos os antimicrobianos testados. As maiores frequências de resistência foram identificadas frente à tetraciclina (85,9%), ampicilina (73,0%), sulfonamida (70,0%), florfenicol (65,0%) e ácido nalidíxico (58,9%). Do total de isolados de E. coli, 79,5% (536/674) foram classificados como multirresistentes. A análise de macro restrição (PFGE), conduzida em isolados apresentando perfis de multirresistência mais prevalentes, demonstrou que isolados de fezes e carcaças eram na maioria dos casos relacionados (similaridade ≥70%) nos três matadouros-frigoríficos. Dos isolados multirresistentes provenientes das carcaças, dez novos antimicrobianos foram testados; em relação a esses, as maiores frequências de resistências foram à cloranfenicol (86,4%), estreptomicina (65,8%) e trimetoprima (57%). Cada matadouro-frigorífico apresentou um perfil distinto de multirresistência predominante. Nos isolados submetidos à pesquisa de genes de resistência, foram detectados por ordem de frequência: strA (83,3%); aac(3)IVa (70%); tetB (70%); sul2 (60%); floR (56,6%); tetA (50%); aph(3)Ia (43,3%); sul3 (26,6%) e blaTEM (10%); três grupos de isolados relacionados (similaridade ≥ 70%) foram encontrados na análise por PFGE. Em relação à etapa 3, os grupos com diferentes protocolos de uso antimicrobianos via ração não apresentaram alteração significativa no perfil de microbiota intestinal e contagem de E. coli; entretanto, os perfis fenotípicos de resistência antimicrobiana foram distintos entre os grupos. O grupo que recebia protocolo com uso alternado de antimicrobianos de seis classes distintas apresentou maior frequência de resistência e multirresistência. De acordo com os resultados encontrados protocolos de uso continuado de antimicrobianos na criação de suínos gera uma pressão seletiva, resultando em cepas multirresistentes que podem sofrer propagação no ambiente e na cadeia de produção de alimentos. Considerando os perfis de resistência encontrados em E. coli originada de carcaças suínas e fezes, em todas as etapas deste trabalho, observou-se que essas cepas são selecionadas na granja pelo uso de antimicrobianos, chegaram ao pré-abate, disseminaram-se na linha de abate e contaminar a carcaça. O uso prudente de antimicrobianos é amplamente citado em toda a literatura científica veterinária e, conforme nossos resultados demonstraram, deve ser incluído entre as metas da suinocultura brasileira.Bacteria resistant to antimicrobials present a hazard not only for animal health but public health too. Commensal bacteria, such as Escherichia coli, are considered a good indicator of microbial population resistance, because they live in gut and are subjected to constant pressure resulting selection of the administration of antibiotics, may survive in slaughtering process and get consumers. In this sense, the aims of this study were: i. to evaluate the frequency of antimicrobial phenotype resistance and presence of clonal groups for E. coli isolated from feces and pig carcasses; ii. to determine phenotypic profile and antimicrobial genotypic resistance in multiresistant E. coli isolated from pig carcasses and identify clonal groups present in pig carcasses; iii. to compare phenotypic profile of antimicrobial resistance in E. coli from swine feces submitted to different antimicrobial in-feed protocols; iv. to describe gut microbiota profile in pigs submitted to different antimicrobial in-feed protocols. For this, three steps were performed. In step 1, two sampling cycles were conducted in three slaughterhouses (A, B, C) of pigs being collected feces deposited in pen floor and pre-chill carcasses. Escherichia coli was isolated from these two sources and evaluated for antimicrobial resistance. In addition, 92 isolates with multidrug resistance profile were analyzed by pulsed-field gel eletrophoresis (PFGE). In step 2, isolated from carcasses and multiresistant underwent new antimicrobial susceptibility testing and in accordance with the phenotypic profile were screened for the resistance gene and PFGE. In step 3, four groups of pigs used different antimicrobial in-feed protocols were followed in all phases and evaluated frequency of antimicrobial resistance and gut bacterial profile by sequencing two regions of 16S rRNA. Among the 674 E. coli isolates from step 1 just 7.4% were susceptible to all antibiotics. The highest frequencies of resistance were: tetracycline (85.9%), ampicillin (73.0%), sulfonamide (70.0%), florfenicol (65.0%) and nalidixic acid (58.9%). Of total E. coli isolates, 79.5% (536/674) were multidrug. Macrorestriction analysis (PFGE), conducted in isolates with profiles more prevalent multidrug resistance showed that isolated from feces and carcasses were in most cases related (≥70% similarity) in the three slaughterhouses. The multiresistant isolates from carcasses, ten new antibiotics were tested, with greatest frequency in add antimicrobial resistance were: chloramphenicol (86.4%), streptomycin (65.8%) and trimethoprim (57%). Each slaughterhouse showed a distinct profile of resistance and number of resistance markers. Isolates submitted to research genes were detected in order of frequency: strA (83.3%); aac(3)IV (70%); tetB (70%); sul2 (60%); floR (56.6%); tetA (50%); aph(3)Ia (43.3%); sul3 (26.6%) and blaTEM (10%); and three related groups (similarity ≥ 70%) were formed in PFGE. For step 3, groups with different antimicrobial in-feed had no significant change in gut microbiota profile and E. coli counts; however the phenotypic profiles of antimicrobial resistance were different between the groups. The group receiving protocol with alternate use of antimicrobials six different classes showed higher frequency of resistance and multidrug resistance. According to the results, different protocols of antimicrobial in pig farming creates a selective pressure, resulting in multi-drug resistant strains that may contribute to spread environment and in food production chain. Considering the resistance profiles found in E. coli originated from swine carcasses and feces, in all stages of this work, it was observed that these strains were selected for in farm by use of antimicrobials, reached the pre-slaughter, spread in the slaughterhouse and carcasses. The concept of prudent use of antimicrobials is widely quoted in all the veterinary scientific literature and, as our results showed, it should be included among the goals of the Brazilian pig farming