Cloning, purification and characterization of two Aspergillus fumigatus accessory proteins involved in sugarcane bagasse deconstruction.

A agroindústria da cana-de-açúcar no Brasil foi um dos setores que mais se desenvolveu nas últimas 4 décadas. Do caminho trilhado desde os canaviais até as bombas de combustível, cerca de 30% da massa de cana-de-açúcar utilizada para a produção de etanol é perdida na forma de palha e bagaço. O resíduo de natureza lignocelulósica, apresenta composição aproximada de 32-48% de celulose, 23-27% de hemicelulose e 19-32% de lignina. Em virtude da resistência física e mecânica oferecida por esse tipo de material, diversas metodologias como pré-tratamentos químicos ou enzimáticos têm sido propostos visando tornar mais acessível a fração polissacarídica do bagaço à quebra em açúcares fermentescíveis passíveis a conversão em etanol de segunda geração. Nesse contexto, o fungo Aspergillus fumigatus apesar de patogênico, apresenta enorme relevância no cenário da desconstrução de resíduos de origem lignocelulósica como o bagaço. Com a recém descoberta das chamadas mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs), metaloenzimas auxiliares à degradação de compostos lignocelulósicos que apresentam notoriedade por conta de seus mecanismos de ação oxidorredutivos, as mesmas já foram encontradas em diversos tipos de microorganismos, incluindo o próprio A. fumigatus. Nesse sentido, o projeto em questão realizou a clonagem e expressão heteróloga na cepa E. coli Rosetta(TM)(DE3)pLysS dos genes AFUA_1G12560 e AFUA_4G07850 responsáveis por codificar respectivamente as enzimas AfuLPMO9A e AfuLPMO9C de A. fumigatus Af293 identificadas em análises de secretoma e RNA-Seq previamente obtidos pelo nosso grupo de pesquisa. Através da análise desses dois genes, foi verificado que na presença de diferentes fontes de carbono, ambos foram induzidos, de modo que na presença de SEB, CMC e Avicel, o gene AFUA_4G07850 foi em até 3500X, 2000X e 1000X mais induzido, enquanto que o AFUA_1G12560 apresentou um aumento moderado de 16X, 13X e 7X, respectivamente. A avaliação da conformação tridimensional, bem como o alinhamento múltiplo com enzimas de maior grau de homologia revelaram algumas características estruturais importantes como a presença de núcleos ricos em estruturas ? em conformação de sanduíche e que importantes resíduos conservados como H20; H105; Y194 e H22; H107; Y196 encontravam-se coordenados ao centro metálico das enzimas AfuLPMO9A e AfuLPMO9C, respectivamente. Uma análise mais profunda baseada em DFT revelou que o sítio ativo de ambas assume uma geometria piramidal de base quadrada. Após purificação das LPMOs, ensaios de atividade revelaram que as enzimas AfuLPMO9A e AfuLPMO9C aumentaram respectivamente em até 1,26X e 1,20X a atividade do coquetel enzimático quando nas concentrações de 10 mg/g Avicel e presença de 0,02% NaN3. Análises mais profundas dessas enzimas auxiliares vão permitir uma maior compreensão sobre o papel desempenhado por elas na desconstrução do bagaço de cana-de-açúcar.The sugarcane agroindustry in Brazil was one of the most developed sectors in the last 4 decades. In the path from cane fields to the gas stations, about 30% of the sugarcane mass used for ethanol production is lost in form of straw and bagasse. The lignocellulosic residue presents approximately 32-48% cellulose, 23-27% hemicellulose and 19-32% lignin. Due to the physical and mechanical resistance offered by this type of material, several methodologies such as chemical or enzymatic pre-treatments have been proposed to make the polysaccharide fraction of the bagasse accessible to the break in fermentable sugars that can be converted into second generation ethanol. In this context, the fungus Aspergillus fumigatus, despite being pathogenic, presents enormous relevance in the scenario of deconstruction of lignocellulosic residues such as bagasse. With the recently discovery of the so-called polysaccharide lytic monooxygenases (LPMOs), metalloenzymes that help the degradation of lignocellulosic compounds and are notorious for their oxidoreductive mechanisms of action, they have already been found in several types of microorganisms, including A. fumigatus. In this regard, this project performed the heterologous cloning and expression in E. coli Rosetta(TM)(DE3)pLysS of the AFUA_1G12560 and AFUA_4G07850 genes responsible for respectively encoding the A. fumigatus Af293 enzymes AfuLPMO9A and AfuLPMO9C identified in secretome and RNA-Seq results previously obtained by our research group. By analyzing these two genes, it was found that in the presence of different carbon sources, both were induced, so that in the presence of SEB, CMC and Avicel, the AFUA_4G07850 gene was up to 3500X, 2000X and 1000X more induced while AFUA_1G12560 presented a lower increase of 16X, 13X and 7X, respectively. The evaluation of the three-dimensional conformation as well as the multiple alignment with higher degree homology enzymes revealed some important structural features such as the presence of cores rich in ? structures in sandwich conformation and that important conserved residues as H20; H105; Y194 and H22; H107; Y196 were coordinated to the metal center of the enzymes AfuLPMO9A and AfuLPMO9C, respectively. Further analysis based on DFT revealed that the active site of both assumes a square-based pyramidal geometry. After purification of LPMOs, activity assays revealed that the enzymes AfuLPMO9A and AfuLPMO9C were able to increase cocktail activity up to approximately 1,26X and 1,20X at concentrations of 10 mg/g Avicel and presence of 0.02% NaN3. Further analysis of these auxiliary enzymes will allow a better understanding of their role in sugarcane bagasse deconstruction