Estudo do fator de transcrição ASR5 em plantas de arroz (Oryza sativa) e identificação de proteínas em resposta ao estresse por alumínio em Arabidopsis thaliana

As plantas são organismos sésseis que continuamente enfrentam situações ambientais adversas, o que acarreta em reduções significativas da biomassa e da produtividade. O trabalho, aqui exposto, teve como objetivo avaliar o papel dos fatores de transcrição ASR (do ingles ABA, stress and ripening) na resposta a estresses abióticos em plantas de arroz. Também teve como objetivo avaliar as respostas de plantas de Arabidopsis thaliana ao estresse produzido nos momentos iniciais da exposição ao metal alumínio. O capítulo 1 da presente tese, compara a expressão de miRNAs entre plantas silenciadas para o gene ASR5 (ASR5_RNAi) e plantas não transformadas (controle). De um total de 279 miRNAs maduros identificados, distribuídos em 60 famílias, 159 foram diferencialmente expressos quando as duas bibliotecas foram comparadas. Uma correlação negativa entre o MIR167 e seu gene alvo (LOC_Os07g29820) também foi confirmada por PCR em tempo real. Este é o primeiro trabalho sugerindo o envolvimento das proteínas ASR na regulação da expressão de miRNAs em planta. O segundo capítulo apresenta o estudo das proteínas ASR na manutenção da homeostase do pH em plantas de arroz. Verificou-se uma diminuição do crescimento radicular em plantas silenciadas em solução ácida, quando comparadas com plantas não transformadas nas mesmas condições. Também foi analisada a viabilidade da ponta de raízes quanto ao dano causado pelo baixo pH e diferentes concentrações de Ca+2, demonstrando que a adição de CaCl2 é capaz de aliviar o efeito tóxico do excesso de protons H+. Diversos genes reprimidos nas plantas silenciadas e envolvidos no mecanismo de manutenção do pH em células vegetais, também foram investigados. O terceiro e último capítulo é dedicado ao estudo da resposta inicial de plantas de Arabidopsis thaliana ao estresse por alumínio. Plantas com 7 dias de idade foram expostas a uma concentração de 25 μM de AlCl3 durante 3 horas e modificações na abundância de proteínas foi investigada com a técnica de espectrometria de massa. Um total de 3.213 proteínas foram identificadas, sendo que destas, 293 apresentaram variação no nível de expressão. Diversas proteínas com expressão induzida são funcionalmente associadas com a detoxificação de espécies reativas de oxigênio (ROS), indicando que o tratamento ocasionou estresse oxidativo nas raízes de A. thaliana. Também foram identificadas uma proteína mitocondrial carreadora de substrato e uma acyl-CoA oxidase com possível papel nos mecanismos de defesa em resposta a alumínio e com potencial para futuros estudos funcionais na planta modelo. De uma maneira geral, os resultados aqui apresentados mostram, pela primeira vez, que ASR5 está envolvida na regulação de miRNAs e na homeostase do pH em plantas de arroz, além de identificar proteínas responsivas ao estresse por alumínio em A. thaliana.Plants are sessile organisms that continuously face adverse environmental situations, leading to a significant reduction in biomass and yield. The aim of the present work was to further study the ASR (ABA, stress and ripening) transcription factors in rice plants. Moreover, the responses of Arabidopsis thaliana to aluminum stress were also analyzed. The chapter 1 of this thesis compares the expression of mature miRNAs in the ASR5 silenced plants (ASR5_RNAi) and in non-transformed plants (control). From a total of 279 mature miRNA of 60 families, 159 were differentially expressed. A negative correlation of MIR167 and its target gene (LOC_Os07g29820) was also confirmed by real time RT-qPCR. This is the first report showing the involvement of ASR proteins in miRNA gene expression regulation. The second chapter presents the study of participation of ASR proteins in the maintenance of pH homeostasis in rice plants. The evaluation of root growth in ASR5_RNAi plants upon acid solution showed inhibition of root growth when compared to non-transformed plants in the same condition. Root tip feasibility and damage caused by low pH and different concentrations of Ca+2 was also analyzed. The results indicate that addition of CaCl2 is capable of alleviating the toxic effects of H+ protons. Several genes downregulated in silenced plants and involved in pH maintenance in plant cells have also been investigated. This work demonstrates the importance of ASR transcription factors in a biological process not yet described. The third and final chapter describes the study of the initial response of Arabidopsis thaliana to aluminum stress. Seven-day old seedlings were treated with 25 μM AlCl3 for 3 hours and submitted to quantitative analyses by mass spectrometry. A total of 3,213 proteins were identified, from which 293 proteins were differentially responsive upon aluminum treatment. Several proteins with increased expression in response to the treatment are functionally associated with reactive oxygen species (ROS), indicating that the Al3+ exposure caused oxidative stress in the roots of A. thaliana. A mitochondrial substrate carrier (At1g78180) and an acyl-CoA oxidase (At3g51840) with a putative role in Al defense were also up-regulated and constitute interesting targets for functional studies of aluminum toxicity in the model plant. Overall, the results here presented show for the first time that ASR5 is involved in miRNA and pH homeostases regulation in rice plants and also identify proteins responsive to aluminum stress in A. thaliana