Avaliação neuromotora e neuroquímica em ratos de diferentes idades submetidos ao tratamento com cafeína durante a gestação e lactação

A cafeína é um psicoestimulante muito consumido na dieta, tendo como principais fontes alimentares o café, o chá verde, refrigerantes de cola e energéticos. Uma vez que a cafeína ultrapassa a placenta e a barreira hematoencefálica, o consumo de cafeína durante a gestação pode afetar o feto em qualquer momento da gravidez. Alguns estudos têm mostrado que o consumo excessivo de cafeína em humanos pode estar associado com o aumento de aborto espontâneo e de baixo peso ao nascer. No entanto, é difícil de controlar fatores de confusão; dessa maneira, estudos experimentais são importantes para avaliar o efeito do consumo de cafeína no desenvolvimento encefálico. No primeiro capítulo desta tese, ratas Wistar foram tratadas com cafeína na água de beber (0,1; 0,3 e 1,0 g/L, o que corresponde à baixa, moderada e elevada ingestão, respectivamente), durante o ciclo escuro em dias de semana, duas semanas antes do acasalamento e durante toda a gestação. As ratas foram sacrificadas no dia embrionário 18 ou 20 (E18 ou E20, respectivamente), e o córtex e o hipocampo dos fetos foram dissecados para análise por Western Blot. Verificamos o imunoconteúdo cortical e hipocampal das seguintes proteínas: Proteína Associada ao Cone de Crescimento (GAP-43), Sonic Hedgehog (Shh), Proteína Associada ao Sinaptossoma (SNAP-25), Fator Neurotrófico Derivado do Encéfalo (BDNF) e seu receptor Tirosina Cinase B (TrkB). Além disso, foi avaliado o número de células neuronais e não-neuronais em ambas idades e regiões encefálicas pela marcação de NeuN. Em E18 no hipocampo, a maior dose de cafeína diminuiu TrkB e aumentou Shh, e a dose moderada (0,3 g/L) reduziu GAP-43; no córtex, houve uma diminuição de BDNF e um aumento de Shh nos embriões expostos à dose mais alta de cafeína nessa idade. No E20, o BDNF cortical foi aumentado pela dose mais elevada, e as doses de 0,3 g/L e 1,0 g/L de cafeína aumentaram Shh no hipocampo. Não houve efeito da dose mais baixa (0,1 g/L) no imunoconteúdo das proteínas estudadas em ambas as estruturas encefálicas e idades embrionárias. O número de células neuronais foi aumentado pela dose mais baixa de cafeína no córtex em E20, e a dose moderada aumentou o número de neurônios hipocampais em E18. A exposição de cafeína durante a embriogênese em roedores influenciou em modificações de proteínas cruciais para o desenvolvimento encefálico. Por isso, seria necessário analisar se estas modificações poderiam refletir em alterações pós-natais no desenvolvimento. Para isso, utilizando a mesma escala de tratamento de cafeína durante a gestação e lactação, verificamos o desenvolvimento motor e reflexo, o metabolismo da cafeína e a sinalização glutamatérgica nos dias pós-natal (DPN) 7, 14 e 21. Não houve diferença no desenvolvimento reflexo dos animais que receberam cafeína. A atividade locomotora aumentou com a idade, mas a cafeína não influenciou na locomoção. No entanto, cafeína a 1,0 g/L reduziu o peso corporal dos filhotes nos DPN 14 e 21, enquanto a exposição à 0,3 g/L de cafeína reduziu o peso corporal no DPN 21. Os níveis plasmáticos de cafeína e teobromina não foram afetados pela idade, mas encontramos interação de idade e tratamento nos níveis plasmáticos de paraxantina e teofilina. No DPN 7, a ingestão moderada de cafeína (0,3 g/L) aumentou o GLT-1 e a razão pGluN1/GluN1 no córtex, enquanto que a dose mais elevada (1,0 g/L) diminuiu o GLT-1 e aumentou a razão pGluN1/GluN1 no hipocampo; todas as doses de cafeína aumentaram o GluA1 hipocampal nesta idade. A dose moderada de cafeína aumentou o mGlu5 em ambas as estruturas encefálicas e aumentou o GluA1 no córtex no DPN 14. Cafeína a 0,3 g/L diminuiu GluA1 e mGlu5 no córtex e aumentou GluN2A hipocampal no DPN 21, e a dose mais elevada também diminuiu o mGlu5 cortical no DPN 21; a dose moderada reduziu o imunoconteúdo hipocampal de GluA1 e mGlu5 nesta idade. A ligação específica ao glutamato (binding) foi transitoriamente reduzida no córtex no DPN 14 pela dose moderada (0,3 g/L), retornando a níveis semelhantes ao controle no DPN 21. Com este trabalho enfatizamos a importância de haver um controle do consumo de cafeína durante um período crítico para o desenvolvimento e maturação encefálica, no entanto mais estudos são necessários para investigar o impacto dessas alterações a longo prazo.Caffeine is the most consumed psychostimulant worldwide, present in coffee, green tea, cola soft drinks and energy drinks. Since caffeine freely crosses placenta and blood-brain barrier during pregnancy, epidemiology studies have found association between caffeine intake and miscarriage and low birth weight; however, some confounding factors may affect the results. Therefore, animal studies are an important tool to evaluate caffeine intake during brain development. In the first chapter of this thesis, adult female Wistar rats received caffeine in the drinking water (0.1, 0.3 and 1.0 g/L) during the active cycle in weekdays, two weeks before mating and throughout pregnancy. Cerebral cortex and hippocampus from embryonic stages 18 or 20 (E18 or E20, respectively) were collected for immunodetection of the following synaptic proteins: brainderived neurotrophic factor (BDNF), TrkB receptor, Sonic Hedgehog (Shh), Growth Associated Protein 43 (GAP-43) and Synaptossomal-associated Protein 25 (SNAP-25). We also estimated the number of NeuN-stained nuclei (mature neurons) and non-neuronal nuclei in both brain regions and embryonic periods. At E18 in hippocampus, high caffeine intake (1.0 g/L) decreased TrkB and increased Shh, whereas the moderate dose reduced hippocampal GAP-43. In whole cortex, BDNF was decreased and Shh was increased in fetuses exposed to the highest dose of caffeine. At E20, BDNF in whole cortex increased at the highest dose, and Shh in hippocampus increased at both moderate and high caffeine doses of caffeine. The lowest dose of caffeine has no effect in all proteins assessed in whole cortex and hippocampus for both embryonic stages. NeuNstained nuclei was increased in the cortex at E20 and in the hippocampus at E18 by lower and moderate doses of caffeine, respectively. Caffeine exposure during rat embryogenesis modified key proteins in brain development. Therefore, it is essential to evaluate whether these changes may reflect in alterations postnatally. For this, using the same protocol of caffeine administration, we studied whether different doses of caffeine intake during pregnancy and lactation may affect reflex and motor development, caffeine metabolism, ontogeny of glutamate receptors and transporter and glutamate binding in cortex and hippocampus in pups at post-natal days (PND) 7, 14 and 21. We did not find differences in reflex development. However, the highest dose decreased body weight from PND 14 up to weaning (PND 21), whereas 0.3 g/L caffeine decreased body weight at PND 21. Locomotor activity increased with age, but it was not modified by caffeine at any dose. Caffeine and theobromine plasma levels were unaffected by age, but there was interaction between age and dose in plasma levels of paraxanthine and theophylline. At PND 7, moderate caffeine intake (0.3 g/L) increased GLT-1 and pGluN1/GluN1 ratio in whole cortex, whereas the highest dose decreased GLT-1 and increased pGluN1/GluN1 ratio in hippocampus. All doses of caffeine increased hippocampal GluA1 at this age. Moreover, moderate dose of caffeine increased mGlu5 in both brain structures and increased GluA1 in whole cortex at PND 14. Caffeine 0.3 g/L decreased cortical GluA1 and mGlu5 and increased hippocampal GluN2A at PND 21. The highest dose also decreased cortical mGlu5 at this age. Conversely, the moderate dose decreased GluA1 and mGlu5 in hippocampus at this age. Glutamate binding were transiently reduced in cortex from rat pups exposed to the lowest dose of caffeine up to PND 14, but it was normalized at PND 21. This work emphasizes the importance of controlling caffeine intake during critical periods of rat brain development and maturation, and more research is needed to evaluate the impact of these changes later in life