Efeitos da urease de majoritária de Canavalia ensiformis sobre o sistema imunitário do hemíptero RHODNIUS PROLIXUS

Ureases são enzimas que possuem atividades biológicas independentes de suas funções enzimáticas, como indução de exocitose e atividade inseticida. Rhodnius prolixus é um dos modelos de inseto sensíveis a essa toxicidade. Quando testada em tecidos isolados de R. prolixus, a urease de Canavalia ensiformis (JBU) causa diferentes efeitos deletérios modulados por eicosanóides. A via de biossíntese dos eicosanóides envolve fosfolipases A2 (PLA2), que são enzimas responsáveis pela liberação de ácido araquidônico (AA). Uma vez liberado, AA pode ser oxigenado na via da ciclooxigenase, a qual produz prostaglandinas (PGs). Em insetos, a resposta imune compreende as reações humoral e celular e é centralmente modulada por eicosanóides, principalmente PGs. Em busca de uma ligação entre o efeito tóxico de JBU e reações imunológicas em insetos, estudamos os efeitos desta toxina em hemócitos de R. prolixus. Descobrimos que JBU ativa a agregação de hemócitos, tanto após injeção na hemolinfa quanto em células in vitro. Em ensaios in vitro, observamos que os inibidores da síntese de eicosanóides, dexametasona e indometacina, inibem a agregação induzida por JBU, sugerindo que produtos da ciclooxigenase modulam a reação. Após hemócitos cultivados serem tratados com JBU, sítios imunorreativos anti-JBU, danos no citoesqueleto e agregação de núcleos foram observados nas células. Também identificamos e clonamos os transcritos de dois genes de PLA2s de R. prolixus, Rhopr-PLA2III e Rhopr-PLA2XII. Analisamos os perfis de expressão de ambos os genes, e observamos que os transcritos são amplamente distribuídos em vários tecidos, porém em diferentes níveis. Utilizando a estratégia de RNAi, silenciamos a expressão de Rhopr-PLA2XII em ninfas de R. prolixus em uma média de 70% entre variados tecidos. Observamos que a toxicidade de JBU foi diminuída em mais de 50% em ninfas com a expressão de Rhopr-PLA2XII diminuída, indicando que o gene está ligado ao efeito tóxico de JBU nesse inseto. No presente estudo demonstramos pela primeira vez a capacidade de uma urease de induzir a agregação de hemócitos. Da mesma forma, os genes de PLA2 aqui apresentados foram os primeiros a serem identificados e a terem seus transcritos clonados em um vetor da doença de Chagas. Nossos resultados estão de acordo com estudos anteriores que demonstraram que eicosanóides modulam a toxicidade de JBU, contribuindo para a compreensão dos mecanismos entomotóxicos de ação dessas proteínas multifuncionais.Ureases are multifunctional enzymes that display biological activities independent of their enzymatic function, including induction of exocytosis and insecticidal effects. Rhodnius prolixus, a major vector of Chagas’ disease, is one of the known susceptible models of this toxicity. When tested in isolated tissues of R. prolixus, jack bean urease (JBU) causes different deleterious effects modulated by eicosanoids. The eicosanoid biosynthetic pathway involves phospholipase A2 (PLA2) enzymes that are responsible for releasing arachidonic acid (AA), along with other products. Once released, AA may enter different enzymatic oxygenation pathways, among which is the cyclooxygenase pathway, yielding products such as prostaglandins (PGs). In insects, the immune response comprises cellular and humoral reactions, and is centrally modulated by eicosanoids, mainly PGs. Searching for a link between JBU toxic effect and immune reactions in insects we have studied the effects of this toxin on R. prolixus hemocytes. We have found that JBU triggers aggregation of the hemocytes either after injection in the hemocoel as well as in isolated cells. In vitro assays in presence of the eicosanoid synthesis inhibitors dexamethasone and indomethacin counteracted JBU's effect, indicating eicosanoids, more specifically cyclooxygenase products, are likely to modulate the reaction. Cultured cells were treated with JBU and immune reactive sites were found in the cells along with damage to the cytoskeleton. The highest concentration of JBU used in the cultured cells also led to nuclei aggregation of adherent hemocytes. We have also identified two genes and cloned the transcripts with complete coding sequences of two PLA2s from R. prolixus, Rhopr- PLA2III and Rhopr-PLA2XII. We have analyzed their expression profiles and found the transcripts to be distributed in various tissues, but at different levels. We have knocked down 70% of Rhopr-PLA2XII expression in 5th instar R. prolixus, and JBU's toxicity was decreased by more than 50%, indicating that Rhopr-PLA2XII gene is linked to JBU's toxic effect in this insect. This was the first time effects of an urease on insect hemocytes were demonstrated. The PLA2 genes here presented were also the first to be identified and to have their transcripts cloned in a Chagas’ disease vector. Our findings support previous data demonstrating that eicosanoids modulate JBU's toxicity, and contribute to the understanding of the mechanisms of entomotoxic action of this multifunctional protein