Genotipificação de Actinobacillus pleuropneumoniae através de métodos moleculares

O Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente da pleuropneumonia suína, doença infecto-contagiosa amplamente distribuída no rebanho suíno mundial e de importância econômica significativa, podendo afetar suínos susceptíveis de várias idades. O agente possui 15 sorotipos conhecidos, os quais podem apresentar reações cruzadas em testes diagnósticos, dificultando a sorotipificação. A determinação do sorotipo de ocorrência em um dado surto e/ou região é importante na promoção da profilaxia, mas não é a única exigência para um efetivo controle. Em razão da diversidade genética e das diferenças na virulência entre as amostras, mesmo em amostras de um mesmo sorotipo, é necessário o desenvolvimento de métodos que possam diferenciar as amostras isoladas a campo em diferentes surtos da doença. O objetivo deste trabalho é o de desenvolver e padronizar técnicas de biologia molecular, visando a genotipificação de isolados de A. pleuropneumoniae. A primeira técnica a ser padronizada foi o RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), na qual foram utilizados os primers OPG-10 e OPG-19 (Operon Technologies). Entretanto, as tentativas iniciais de padronização da técnica evidenciaram que a mesma possui uma baixa reprodutibilidade. Em vários experimentos, amostras em duplicata divergiam quanto ao padrão de amplicons obtidos. A segunda foi a ERIC-PCR – técnica molecular baseada na amplificação por PCR de sequências de consenso presentes em elementos palindrômicos repetitivos (ERIC – Enterobacterial Repetitive Intragenic Consensus). O método ERIC apresentou reprodutibilidade entre amostras em duplicata e distinção efetiva dos diferentes sorotipos e amostras de campo. O padrão de amplicons gerado pela técnica também permitiu minuciosa análise filogenética das amostras isoladas de campo, na qual todas as amostras testadas puderam ser identificadas e caracterizadas individualmente, podendo ser agrupadas em subpopulações filogeneticamente relacionadas. A partir dos resultados obtidos é possível realizar estudos epidemiológicos mais detalhados do agente no nosso meio. A pesquisa alcançou seus objetivos na diferenciação dos isolados, porém, outros métodos devem ser pesquisados e padronizados para auxiliar a sorotipificação e a genotipificação do agente. Entre eles podemos citar a identificação dos genes que codificam para as toxinas Apx (Actinobacillus pleuropneumoniae RTX toxins) e as técnicas RFLP (restriction fragment length polymorphism) e AFLP (amplified fragment length polymorphism).The Actinobacillus pleuropneumoniae is the agent of porcine pleuropneumonia, contagious infectious disease widely distributed in the world and of significant economic importance, affecting susceptible pigs of various ages. The agent has 15 known serotypes, which may cross-react in diagnostic tests, making it difficult to serotyping. Determining the serotype of occurrence in a given outbreak and / or region is important in promoting prevention, but it is not the only requirement for effective control. Due to the genetic diversity and differences in virulence between samples, even in samples of the same serotype, it is necessary to develop methods that can differentiate isolates the field in different outbreaks. The objective of this work is to develop and standardize techniques of molecular biology, aiming genotyping of isolates of A. pleuropneumoniae. The first technique to be standardized was RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), in which the primers used were OPG-10 e OPG-19 (Operon Technologies). However, initial attempts to standardize the technique showed that it has a low reproducibility. In several experiments, duplicate samples differed in the pattern of amplicons. The second was the ERIC-PCR - molecular technique based on PCR amplification of consensus sequences present in repetitive palindromic elements (ERIC – Enterobacterial Repetitive Intragenic Consensus). The method showed reproducibility between duplicate samples and effective distinction of different serotypes and field samples. The pattern of amplicons generated by the technique also allowed detailed phylogenetic analysis of strains isolated from field, in which all the tested samples could be identified and characterized individually and can be grouped into phylogenetically related subpopulations. From the results obtained it is possible to perform more detailed epidemiological studies of the agent in our midst. The study achieved its objectives in the differentiation of isolates, however, other methods must be researched and standardized to help serotyping and genotyping the agent. Among them we can cite the identification of the genes encoding the toxins Apx (Actinobacillus pleuropneumoniae RTX toxins) and the techniques RFLP (restriction fragment length polymorphism) and AFLP (amplified fragment length polymorphism)