Estudo das funções da proteína Kin3 de Saccharomyces cerevisiae na resposta a danos no DNA

A resposta de células eucarióticas após exposição a estresse genotóxico é a ativação de uma intrincada rede de sensores, transdutores e efetores envolvidos em vias de reparação de DNA e controle de ciclo celular. Para garantir a fidelidade dessas vias regulatórias, existem mecanismos celulares evolutivamente conservados, chamados pontos de checagem, que monitoram a estrutura dos cromossomos, coordenando reparação de DNA e progressão do ciclo celular, controlando a capacidade da célula em parar o ciclo celular como resposta a danos no DNA, concedendo tempo para que ocorra a reparação. Os processos de reparação de danos no DNA são bem estabelecidos, porém, a sinalização para ativação de parada de ciclo celular na resposta a estas lesões é menos conhecida. A proteína Kin3 é uma serina treonina cinase de Saccharomyces cerevisiae estruturalmente relacionada à NIMA, um regulador mitótico descrito inicialmente no fungo Aspergillus nidulans, o qual está envolvido na regulação da progressão da fase G2/M e na organização de alguns eventos mitóticos. Como a maioria dos reguladores de ciclo celular é conservada, neste trabalho avaliou-se a função de Kin3p na resposta a danos no DNA. Nossos resultados demonstram que a deleção do gene KIN3 induz sensibilidade a cisplatina, doxorubicina, mustarda nitrogenada e MMS. Além disso, o mutante kin3 não apresenta uma parada de ciclo celular eficiente no ponto de checagem G2/M e uma diminuição da reparação das quebras no DNA após estes tratamentos, sugerindo que Kin3p possa estar envolvida no reconhecimento ou sinalização destas quebras. A expressão do gene KIN3 em resposta a estresse genotóxico está aumentada, assim como há um aumento da expressão da proteína codificada por este gene. O co-tratamento com cafeína, um inibidor das proteínas de sinalização de danos no DNA Mec1 e Tel1, induz um aumento da sensibilidade aos agentes genotóxicos no mutante kin3 e diminui a expressão do gene KIN3 na linhagem selvagem, sugerindo que a proteína Kin3 possa atuar em uma via de sinalização dependente de Mec1p/Tel1p. Na busca por esclarecimentos a respeito da via de atuação da proteína Kin3, avaliou-se a interação da mesma com as proteínas do complexo Mre11p/Rad50p/Xrs2p, já que previamente Mrellp tinha sido apontada como parceira molecular da proteína relacionada a NIMA de humanos Nek1. Nossos resultados de interação in vitro utilizando o sistema duplo híbrido, demonstraram que a proteína Kin3 interage com cada uma das proteínas do complexo MRX. Esta interação foi confirmada pela epistasia entre os mutantes kin3Δ e mrelΔl, rad50Δ ou xrs2Δ em ensaios de sensibilidade a cisplatina, mustarda nitrogenada e 8-MOP foto-ativado. A expressão do gene KIN3, que como mencionada anteriormente está aumentada na resposta a estresse genotóxico na linhagem selvagem, também está aumentada nos mutantes do complexo MRX, demonstrado que a ativação do gene KIN3 independe da formação do complexo MRX. O conjunto de dados apresentados nesta tese demonstra, pela primeira vez, o envolvimento da proteína Kin3 na resposta a agentes indutores de adutos no DNA, em uma via dependente de Tel1p/Mec1p, através da interação com o complexo MRX. Embora, o progresso no entendimento dos mecanismos de detecção, sinalização e reparação de danos no DNA tem sido grande, muitos detalhes moleculares ainda esperam por respostas e o estudo de novas proteínas pode ser importante para o entendimento destas lacunas.The eukaryotic cells response to genotoxic stress is the activation of an intricate network of sensors, transducers and effectors involved in DNA repair pathways and cell cycle control. These regulatory pathways must be quite faithful. To reach this fidelity, there are cellular mechanisms evolutively conserved, called cell cycle checkpoints, which monitor the structure of chromosomes and coordinate DNA repair, cell cycle progression by controlling the cell's ability to stop the cell cycle in response to DNA damage, providing time for repair to occur. The DNA damage repair mechanisms are well established. However, the signaling for cell cycle arrest activation in response to these lesions is less well known. Kin3 protein is a serine/threonine kinase of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae that is related to the NIMA (Never-In Mitosis, gene A) protein of Aspergillus nidulans, which is involved in the response to DNA damage, regulation of G2/M phase progression and is important for orderly mitotic events. Since the majority of cell cycle regulators are conserved throughout the eukaryotic domain, in this work we show that KIN3 gene deficient cells present sensitivity and fail to arrest properly at G2/M-phase checkpoint in response to the DNA damage inducing agents MMS, cisplatin, doxorubicin and nitrogen mustard, suggesting that Kin3 can be involved in DNA strand breaks recognition or signaling. In addition, there is an increase in KIN3 gene expression in response to the mutagenic treatment, which was confirmed by the increase of Kin3 protein. We also showed that co-treatment with caffeine, a Mec1 and Tel1 signaling DNA damage proteins inhibitor, induces a slight increase in the susceptibility to genotoxic agents in kin3Δ cells and abolishes KIN3 gene expression in wild-type strain, suggesting that Kin3 protein can play a role in Tel1/Mec1-dependent pathway activation induced after genotoxic stress. In search for understanding the Kin3 action mechanism in DNA damage response, we evaluated the interaction of this protein with each component of Mre11/Rad50/Xrs2 complex, since Mre11 had previously been identified as Nek1 (NIMA-related human protein) molecular partner. Taking into account that the phenotype of Kin3-deficient cells is rather similar to Nek1-deficient cells and that the MRX complex is highly conserved, we show that the Kin3 protein interacts with each protein of the MRX complex using a two-hybrid assay. These results were confirmed by the epistasis observed between KIN3 and MRX in the sensitivity to cisplatin, nitrogen mustard and photo-activated 8-methoxypsoralen. The KIN3 gene expression was upregulated in the wild type strain after mutagenic stress, in the same way, is also increased in MRX mutants demonstrated that KIN3 gene activation is independent of MRX complex formation. The data presented in this thesis demonstrate, for the first time, the involvement of Kin3 DNA adducts damage response in Tel1/Mec1 dependent pathway, by MRX complex interaction. Although progress in understanding the mechanisms of detection, signaling and repair of DNA damage has been increased, many molecular details are still waiting for answers and the study of new proteins may be important for the understanding of these gaps