Resveratrol e quercetina : avaliação da atividade antitumoral e dos mecanismos de ação em linhagens de gliomas in vitro e em um modelo de implante de gliomas in vivo

Dentre os tumores cerebrais primários, o glioblastoma (GBM) é o mais comum, apresentando alta taxa de mortalidade e morbidade. O tratamento convencional desses tumores tem surtido pouco efeito, com alta taxa de recorrência e progressão da doença. Neste trabalho, buscou-se aprimorar o conhecimento sobre a biologia destes tumores e, utilizando polifenóis amplamente distribuídos na natureza, procurar novas formas de terapia. Nesta tese demonstrou-se que o tratamento com resveratrol e quercetina diminuíram o número de células de maneira tempo e dose dependente em linhagens de GBM humano (U87 e U138), de camundongo (GL261) e de rato (C6), sendo a última a mais sensível e a utilizada neste trabalho. Esse efeito foi observado apenas em linhagens tumorais, não ocorrendo em cultura primária de astrócitos. Resveratrol em altas doses (50 M) induziu apoptose, necrose e parada no ciclo celular. Agudamente, o tratamento com doses baixas de resvetraol (10 M) mais quercetina (25 M) – 24 a 72 h - induziu apoptose, enquanto cronicamente – 12 dias – induziu senescência celular. Esses efeitos não ocorreram quando esses compostos foram utilizados isoladamente. Até então, a indução de senescência pela combinação destes compostos não tinha sido demonstrada. Como provável mecanismo de ação demonstrou-se que o tratamento combinado destes polifenóis induziu senescência através da indução de quebra dupla de DNA e ativação da via da p53. O tratamento com as drogas isoladas não induziu dano ao DNA. A partir de então, investigou-se o efeito destes compostos em um modelo in vivo de implante de gliomas em ratos. Inesperadamente, a quercetina (50 mg/kg/dia intraperitoneal (i.p.)) induziu aumento do volume tumoral, o que não foi observado com o resveratrol (30 mg/kg/dia i.p.) e com a combinação de resveratrol mais quercetina. Para explicar este efeito prevalente do resveratrol nós elaboramos as seguintes hipóteses: 1. necrose/angiogênese: por diminuir a necrose o resveratrol pode ter diminuido a angiogênese, que pode ter sido aumentada pela quercetina; 2. Modulação do sistema imunológico: a quercetina foi capaz de imunussuprimir os animais (por diminuir a proliferação das células T-periféricas após estimulação por fitohemaglutinina e concanavalina A) e a combinação de resveratrol mais quercetina aumentou a estimulação das células T periféricas. Hipoteticamente, atribuiu-se a divergência entre o efeito antitumoral in vitro e in vivo à ausência de senescência neste último, o que pode ser indicado pela ausência da diminuição do índice mitótico. Além disso, o estresse da cultura, um fator indutor de senescência celular, é perdido no modelo in vivo. Com base nos resultados aqui apresentados concluí-se que o resveratrol e a quercetina possuem um potencial antitumoral em gliomas in vitro que precisa de estudos mais aprofundados in vivo para melhorar o conhecimento dos efeitos exercidos por estes afim de se estabelecer uma dose segura para o tratamento dessa e de outras doenças para as quais essas moléculas possam vir a ser utilizadas.Glioblastoma (GBM) is the most common primary brain tumor, with high mortality and morbidity. The conventional treatment of these tumors has little effect, with high recurrence and progression of the disease. In this work, we set out to better understand the biology of these tumors, looking for new treatment approaches, and, by using polyphenols widely spread on nature, seek for new forms of therapy. In this thesis we demonstrated that the resveratrol and quercetin treatment decreased the cell number in a time and dose dependent manner in GBM cell lines from human (U87 and U138), mouse (GL261) and rat (C6) being the last the most sensitive and therefore the cell line used in this work. This effect was not observed in primary astrocyte cell culture. Higher doses of resveratrol (50 M) induced apoptosis, necrosis and cell cycle arrest. Acutely, the treatment of lower doses of resveratrol (10 M) plus quercetin (25 M) – 24 to 72 h - induced apoptosis while chronically – 12 days – this treatment induced cell senescence. These effects did not occur when the compounds were utilized alone. Until now, the induction of senescence by the combination of these compounds had not been demonstrated. As a probable mechanism of action it was showed that the cotreatment of these polyphenols induced senescence through inducing DNA damage by generating DNA double strand breaks and activating the p53 pathway. The treatment with the drugs alone did not induce DNA damage. These findings lead us to investigate the effect of these compounds in an in vivo rat glioma experimental model. Unexpectedly, quercetin (50 mg/kg/day) induced an increase in the tumor volume, which was not observed for resveratrol (30 mg/kg/dia) and the combination of the resveratrol plus quercetin. To explain this prevalent effect of resveratrol it was elaborated the following hypotheses: 1. necrosis/angiogenesis: by decreasing the necrosis, resveratrol can diminish the angiogenesis, that can be increased by quercetin; 2. modulation of immunological system: quercetin was able to imunossupress the animals (by diminishing the peripherical T-cells proliferation upon phytohemmaglutinin and concanavalin A stimulation) and the combination of resveratrol plus quercetin increased the peripherical T-cell proliferation. Hypothetically, the divergence between the in vitro and in vivo antitumoral effect was attributed to the absence of senescence induction in the latter that can be indicated by the lack of mitotic index decrease. Besides, the culture stress, a senescence inductor factor, is lost in the in vivo model. Based in the results presented here, we concluded that resveratrol and quercetin have a potential antitumoral effect in GBM in vitro and this potential needs more in vivo studies to better harvest this potential and to establish a safe concentration to treat this and other diseases in which these compounds could be used