Ureases de Canavalia ensiformis : processamento e mecanismo de ação em insetos

Ureases (E.C. 3.5.1.5) são metaloenzimas distribuídas em plantas, fungos e bactérias. As duas isoformas de ureases de Canavalia ensiformis (canatoxina - CNTX e urease do feijão de porco - JBU) são altamente tóxicas para insetos de diferentes ordens. A toxicidade dessas proteínas é dependente da liberação de um fragmento de cerca de 10 kDa a partir da proteína nativa. Essa liberação se dá por ação das enzimas digestivas cisteínicas e aspárticas (tipo catepsina B e D) presentes no trato digestivo de algumas ordens de insetos. Ureases não são tóxicas para insetos com digestão baseada em enzimas serínicas (tipo tripsina). Esse peptídeo de 10 kDa foi isolado e caracterizado, recebendo o nome de Pepcanatox. Um peptídeo recombinante, equivalente ao Pepcanatox, foi expresso em Escherichia coli e chamado Jaburetox 2Ec. Jaburetox 2Ec é tóxico, por via oral, para ninfas de Dysdercus peruvianus e, por injeção toráxica, para ninfas de Rhodnius prolixus e ninfas e adultos de Triatoma infestans. CNTX e JBU, dados por via oral, são tóxicos para ninfas de D. peruvianus e R. prolixus, mas não são tóxicas para as formas adultas desses insetos.O processamento de CNTX e JBU por enzimas de ninfas e adultos de D. peruvianus mostraram um perfil distinto, podendo ser esse diferencial o responsável pela falta de efeito tóxico observado em adultos. Usando Callosobruchus maculatus como modelo, as enzimas responsáveis pelo processamento das ureases foram investigadas. Usando Callosobruchus maculatus como modelo, as enzimas responsáveis pelo processamento das ureases foram investigadas. A purificação parcial das enzimas de C. maculatus por gel-filtração resultou em uma fração (Pico B) capaz de liberar um peptídeo de aproximadamente 10 kDa a partir de CNTX e JBU. A atividade proteolítica do Pico B é completamente inibida por Pep-A e parcialmente inibida por E-64, indicando a presença de aspártico (majoritária) e cisteíno proteases. Observamos que tanto E-64 (inibidor de cisteíno proteinases) quanto Pepstatina-A (inibidor de aspártico proteinases) diminuem a formação do peptídeo entomotóxico pelo Pico B, sugerindo que cisteíno e aspártico proteases estão envolvidas nesse processo.O mecanismo de ação em insetos das ureases, assim como dos peptídeos derivados, ainda não é conhecido. Um efeito observado in vivo é a diminuição da taxa de perda de peso de R. prolixus após a alimentação com ureases, indicando uma possível alteração no sistema excretório. Para avaliar o efeito das ureases e de Jaburetox 2Ec na secreção de R. prolixus, realizamos ensaios de secreção de fluídos pelos túbulos de Malpighi isolados, assim como ensaios de contrações dos intestinos anterior e posterior e vaso dorsal. JBU e Jaburetox 2Ec inibem a secreção de fluídos por túbulos de Malpighi isolados, de maneira dose dependente. CNTX também tem efeito antidiurético, enquando a urease de Helicobacter pylori (HPU) não causa nenhuma alteração na secreção dos túbulos de Malpighi. Jaburetox 2Ec, mas não JBU, causa um aumento dos níveis de GMPc nos túbulos sendo esse o segundo mensageiro de sua ação.Metabólitos de eicosanóides e cálcio (intra e extracelular) influenciam a ação de JBU, mas não de Jaburetox 2Ec. Ensaios de potencial transepitelial realizados com túbulos de Malpighi indicaram que Jaburetox 2Ec, mas não JBU, alteram a ação de uma H+-ATPase presente na membrana dos túbulos, causando um desequilíbrio no transporte iônico e, como consequência, alteração na secreção de fluídos. Os dados obtidos não mostram que JBU e Jaburetox 2Ec desencadeiam rotas distintas nos túbulos de Malpighi, ambos culminando em antidiurese. Assim como nos túbulos de Malpighi, JBU diminui o transporte de fluídos pelo epitélio do estômago de R. prolixus. Jaburetox 2Ec e JBU causam um aumento na frequência de contrações do estômago estimuladas por serotonina. No intestino posterior, observamos que JBU também causa um aumento na frequência e amplitude das contrações, e mudança no tônus basal do tecido. No vaso dorsal, nenhuma alteração significativa nas contrações foram observadas. Também avaliamos por microscopia o efeito da alimentação com JBU na liberação de serotonina, hormônio envolvido em diversos processos fisiológicos. Não observamos nenhuma alteração significativa na liberação desse hormônio a partir das células do sistema nervoso, assim como nos órgãos controlados por serotonina. A liberação de fragmento(s) entomotóxico(s) a partir de ureases vegetais, assim como o mecanismo de ação dessas ureases e fragmentos, são processosbastante complexos. Nessa tese tivemos êxito em caracterizar várias etapas desses processos, esclarecendo pontos chaves e levantando evidências para guiar trabalhos futuros.Ureases (E.C. 3.5.1.5) are metalloenzymes widespread in plants, fungi and bacteria. Two isoforms of Canavalia ensiformis urease, (canatoxin - CNTX and jack bean urease – JBU), are toxic to insects from different orders. The toxicity of these proteins is due to the release of a 10 kDa peptide from the native protein. This release is due to the action of acidic digestive enzymes present in the insect digestive tract. Ureases are not toxic to insects with digestion relying on trypsin-like enzymes. The entomotoxic peptide, called Pepcanatox, was isolated and characterized and a recombinant peptide, equivalent to Pepcanatox was expressed in Escherichia coli. Jaburetox 2Ec, the recombinant peptide, is toxic by oral route to nymphs of Dysdercus peruvianus and by injection to nymphs of Rhodnius prolixus and nymphs and adults of Triatoma infestans. CNTX and JBU, administered by oral route, are toxic to nymphs of D. peruvianus and R. prolixus, but are innocuous to adults of these insects. Proteolytic processing of JBU and CNTX by digestive enzymes from D. peruvianus nymphs and adults showed a distinct profile. This differential processing could be related to the lack of toxic effect of the proteins in adults.Using Callosobruchus maculatus as a model, the digestive enzymes involved in urease’s processing were investigated. The partial purification of C. maculatus enzymes resulted in a protein fraction (Pool B) capable of releasing a 10kDa peptide from JBU and CNTX. The proteolytic activity of Pool B was completely abolished by Pep-A and partially inhibited by E-64, indicating the presence of aspartic (majoritary) and cysteine proteinases. Both E-64 and Pep-A decrease the formation of the entomotoxic peptide, suggesting that both classes of enzymes may be involved in this process. The purification of the enzymes present on Pool B will clarify the role of each of these enzymes on urease processing and release of the entomotoxic peptide. The mechanisms of action of ureases as well as urease-derived peptides in insects is still poorly characterized. A lower rate of weight loss in R. prolixus fed on a urease-containing meal was observed in vivo, indicating a possible alteration on theexcretory system. To evaluate the effect of ureases and Jaburetox 2Ec on R. prolixus excretion, we performed fluid secretion assays on isolated Malpighian tubules, as well as fore- and hindgut contractions assays. JBU and Jaburetox 2Ec inhibit Malpighian tubules fluid secretion in a dose dependent fashion. CNTX is also antidiuretic, while Helicobacter pylori urease (HPU) does not alter the secretion rate. Jaburetox 2Ec, but not JBU, increases tubules levels of cGMP. No changes in AMPc was seen with either polypeptide. Eicosanoid metabolites and calcium (intra- and extracellular) modulate the antidiuretic effect of JBU, but not that of Jaburetox 2Ec. Measurements of the transepithelial potential in Malpighian tubules indicated that Jaburetox 2Ec, but not JBU, disrupts the activity of a H+-ATPase present on tubules’ membranes, causing changes in fluid secretion due to an imbalance of ions transport. The data obtained show that JBU and Jaburetox 2Ec are acting on Malpighian tubules through different pathways, both leading to antidiuresis. As seen in Malpighian tubules, JBU also decrease the fluid transport across the crop epithelium of R. prolixus. Jaburetox 2Ec and JBU cause an increase of the frequency of crop contractions stimulated with serotonin. In the hindgut, JBU increases the frequency and amplitude of contractions, and alters the muscle basal tonus. In the dorsal vessel, no significant alterations were observed. Using microscopy, we also evaluated the effect of JBU feeding in the release of serotonin, a hormone involved in several physiological processes. There is no alteration in the release of this hormone from nervous system cells, as well as in tissues regulated by serotonin. All these data indicate that JBU and its derived peptide cause major alterations of post feeding physiological process in R. prolixus that contribute to, or can be the cause of the entomotoxic effect. The release of entomotoxic fragment(s) from plant ureases and their mechanism of action are complex processes. Here, we were successful in characterizing several steps of these processes, clarifying crucial points and providing leads for future work in this field