Purification and characterization of an antimicrobian peptide produced by Bacillus liqueniformis

Bacillus licheniformis P40 produz uma bacteriocina que apresenta potencial para utilização como bioconservante no controle de microrganismos patogênicos e deteriorantes de alimentos entre os quais se destacam Listeria monocytogenes, Bacillus cereus e Erwinia carotovora. Estas substâncias possuem grande potencial biotecnológico que pode ser explorado pela indústria alimentícia. Assim sendo, este trabalho teve como objetivos a purificação e incorporação do peptídeo antimicrobiano em nanovesículas. A bacteriocina foi incorporada em nanovesículas de fosfatidilcolina, resultando em partículas de cerca de 570 nm. Houve Inibição completa do crescimento de L. monocytogenes com a adição de 100 e 50 UA.mL-1 de bacteriocina encapsulada e livre, respectivamente. Observou-se uma redução no número de células viáveis para zero após 12 minutos de incubação com 400 UA.mL-1 de bacteriocina encapsulada e livre, apresentando uma estabilidade de até 28 dias a 4ºC, para a forma encapsulada.O composto bacteriano foi purificado através de etapas de precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de gel-filtração em Sephadex G-100 e cromatografia de fase reversa em Source-RPC. A purificação resultou num fator de 100 vezes com rendimento de 0.3%. A massa molecular do peptídeo foi determinado em cerca de 800 Da por espectrometria de massas. A bacteriocina étermo-resistente, suportando aquecimento a 100ºC por 5 minutos, e estável na faixa de pH de 6 a 10, porém sensível à ação de pronase E, butanol e ácido tricloroacético. O experimento realizado revelou ainda propriedades emulsificantes desta substância. Dados de espectroscopia de infravermelho indicaram uma estrutura molecular semelhante à de lipopeptídeos como, a surfactina e a lichenisina. Em relação à toxicidade frente a hemácias, em testes qualitativos, aferiram-se propriedades atóxicas, o que pode sugerir estudos mais detalhados sobre ensaios toxicológicos para uma provável utilização em produtos alimentícios.Bacillus licheniformis P40 produces a bacteriocin that presents potential for use as biopreservative in the control of pathogenic and spoilage microorganisms like Listeria monocytogenes, Bacillus cereus and Erwinia carotovora. In that way, these substances present a biotechnological interest that it can be explored by the food industry. This work has as objectives the purification and incorporation of antimicrobial peptide into nanovesicles. The bacteriocin was incorporated in phopholipidic nanovesicles, resulting in particle size of about 570 nm. There was complete inhibition of the growth of L. monocytogenes with the addition of 100 and 50 UA.mL-1 of encapsulated and free bacteriocin, respectively. It was observed a reduction in the number of viable cells to zero after 12 minutes incubation with 400 UA.mL-1 of encapsulated or free bacteriocin, presenting a stability of until 28 days to 4ºC for the encapsulated form.The bacterial composition was purified through steps of precipitation with ammonium sulfate, gel-filtration chromatography in Sephadex G-100 and reverse phase chromatography Source-RPC. The purification factor was 100 fold with yield of 0.3%. The molecular mass of the peptide was determined as about 800 Da by mass spectrometry. The bacteriocin was heat resistant, supporting heating at 100ºC for 5 minutes, was stable at pH from 6 to 10, but sensitive to the action of pronase E, butanol and trichloroaceticacid. Accomplished experiment indicated the peptide has emulsifying properties. Infrared spectroscopy indicated a molecular structure similar to some lipopeptides like surfactin and lichenisin. In relation to the toxicity front erythrocytes, non-toxic properties were observedd, which indicate more detailed studies on toxicological rehearsals for a probable use in food products