Expression of matrix gla protein (MGP) in breast cancer: a molecular and cellular approach

Dissertação de mestrado, Oncobiologia - Mecanismos Moleculares do Cancro, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2017Every year around 8.2 million people die due to cancer, in Portugal, breast cancer is the leading cause of women death (in cancer patients). Several risk factors could be pointed being age (over 50 years old), gender (females), reproductive and hormonal factors and genetic predisposition (presence of mutations in BRCA 1 and BRCA 2) the most commons. Staging is done regarding several aspects, e.g.: histology, histopathologic localization, hormone receptors, mutations or expression of cluster genes. Research from last decades is focused into targeted therapies. MGP, matrix Gla protein, was pointed as a possible target. MGP primary structure consists in a signal peptide, a phosphorylation domain and a γ-carboxylase recognition site. MGP has also five Gla residues. For a long time, only an isoform with four exons was known, but recently was discovered a second isoform with five exons, with three additional putative binding sites, conferring, possible, a higher binding capability as well as a presumably higher calcification inhibitory power. Although MGP role in cancer is not fully understood, being upregulated in some types of tumors and downregulated others, in breast cancer, was established, as a prognostic factor, being overexpressed in poor diagnose cases. Being MGP role in tumorigenesis to be defined, the aims of this work were: clarify MGP expression in normal vs tumoral tissue (using in silica method – TCGA database); as well as clarify regulatory mechanisms of MGP (TCGA database); analyze expression of each isoform in breast cancer cell lines (results were obtained performing qRT-PCR followed by electrophoresis and sequencing of the extracted bands) and assess the result of overexpression of each isoform (using XTT and wound healing assay). We could conclude that both variants could be expressed in simultaneous. Every cell line presented E4 isoform but just a few presented E5 isoform. Hound healing assay revealed that an overexpression of E4 and E5 variants slow down the rate of the area invaded by migrating cells, specially an overexpression of E4 isoform. After in silica analyze we could conclude that MGP is more expressed in tumoral tissue vs normal tissue, existing a negative correlation between MGP expression and mir155 expression and methylation, that means that: in tumoral tissue mir155 is less expressed than in normal tissue and occurs an hypomethylation in tumoral tissue. Knowing that MGP inhibits calcification and is correlated with angiogenesis, our hypothesis is that overexpression of MGP in tumoral tissue is a mechanism of cancer to facilitate angiogenesis – a hallmark of cancer.Introdução: o cancro é caracterizado por um crescimento anormal e incontrolado de células que podem adquirir características malignas por acumulação de mutações. Hanahan and Weinberg (2000) descreveram que o desenvolvimento tumoral baseado em vários passos está assente na aquisição, por parte do tumor, de seis princípios biológicos: i) manter sinalização proliferativa; ii) desenvolver mecanismos de defesa contra supressores de crescimento; iii) resistir á morte celular; iv) ativar imortalidade replicativa, v) induzir angiogénese e vi) ativar invasão e metástase. Se uma visão mais tradicional atribuía estas alterações ao resultado de mutações genéticas, uma visão mais atual do cancro engloba também a epigenética como fator crucial na repressão e ativação de genes capazes de conferir as características malignas aos tumores; a metilação genómica é um exemplo de um mecanismo já descrito com um papel importante na atividade tumoral, sendo que está associado a hipometilação do genoma com o cancro. Determinar os mecanismos moleculares desta doença aproximam a população científica de terapias alvo que permitam ajudar a controlar a disseminação desta doença que é considerada pela organização mundial de saúde uma doença epidémica em ascensão. Todos os anos morrem no mundo 8.2 milhões de pessoas devido a cancro (cerca de 13% de todas as mortes do mundo), sendo a segunda causa de morte em Portugal, EUA e Europa. Em Portugal, o cancro do pulmão e brônquios é a primeira causa de morte por cancro nos homens, enquanto que a primeira causa de morte por cancro nas mulheres é o Cancro da Mama (CM). Existem vários fatores de risco para o CM, sendo os principais: i) idade acima dos 50 anos; ii) ser do sexo feminino (apenas 1% dos casos corresponde a homens); iii) história pessoas ou familiar de CM; iv) fatores reprodutivos e hormonais; v) exposição endógena a estrogénios (como p.e. uso da pílula) e vi) predisposição genética (comumente mutação nos genes BRCA1 e BRCA2). O estadiamento da doença é feito usando TNM (avalia tamanho do Tumor, Nódulos e Metástases). Contudo, outras características são usadas em cancro para definir o tratamento, nomeadamente: localização histopatológica (divide os carcinomas in situ dos carcinomas invasivos); expressão de determinados recetores hormonais e expressão de genes em clusters/aglomerados (conferindo a divisão em Luminal A, Luminal B, HER2 e tipo basal), sendo que nas últimas décadas tem se procurado encontrar terapias direcionas, sendo que cada vez mais se procuram novos alvos terapêuticos. Um possível alvo terapêutico é a MGP (proteína Gla da matriz). Está localizada no braço pequeno do cromossoma 12 (12p12.3) e é uma proteína dependente da vitamina K. A sua estrutura primária consiste num péptido de sinal, um domínio de fosforilação e um local de reconhecimento da γ-carboxilase; tem também cinco resíduos Gla que após conversão pela enzima γ-glutamil carboxilase passam a ter uma maior afinidade para minerais e iões minerais (como o cálcio, fosfato e cristais de hidroxiapatite – componentes minerais do esqueleto). Durante muito tempo apenas uma variante era conhecida E4 (quatro exões) contudo foi identificada uma nova isoforma: E5 (cinco exões), que apresenta três locais putativos adicionais de ligação a γ-carboxilação; esta característica pode provocar um aumento da sua capacidade de ligação, levando a um poder inibitório mais forte. MGP está associada à inibição de calcificação (devido à sua afinidade de ligação mineral e iónica), e mutações neste gene estão associadas a aterosclerose (calcificação vascular), síndrome de Keutel e cancro. No caso do cancro estudos revelam um papel na diferenciação, proliferação e migração celular, no início da angiogénese e na tumorigénese. Contudo o seu papel na oncogénese e a correlação entre a sua expressão e o tipo de tumores está ainda por determinar; sendo que para alguns tipos de tumores, apresenta maior expressão no tecido tumoral e em outros mais em tecido normal. No cancro da mama contudo, tem sido apontado como fator de prognóstico, estando a sua sobreexpressão associada a um pior prognóstico. Objectivos: Estando o papel da MGP no cancro ainda por definir, o principal objetivo deste trabalho passa por tentar correlacionar a sua expressão em tecido normal e tumoral assim como em subgrupos de pacientes; clarificar a expressão das variantes em linhas celulares do cancro da mama, assim como qual o resultado a sobreexpressão das variantes na proliferação e migração celular e, identificar mecanismos regulatórios da MGP e o sua expressão em tecido normal vs tumoral. Materiais e métodos: Para cada linha celular foi averiguado qual a(s) variante(s) expressa(s), recorrendo para isso a qRT-PCR e posteriormente a uma confirmação por sequenciação das bandas obtidas por electroforese, das amostras do qRT-PCR. O efeito da sobreexpressão das isoformas na proliferação e migração celular foi avaliado em duas linhas celulares da mama (linhas não comerciais) previamente transfetadas com o plasmídeo de interesse (E4, E5 e um vector vazio usado como controlo) que foram sujeitadas a ensaios de XTT e do risco. A relação entre a expressão da MGP em tecidos tumorais, assim como a análise da expressão do mir155 foi averiguada recorrendo a um estudo in silico a partir da base de dados The Cancer Genome Atlas (TCGA). Usou-se esta ferramenta também para avaliação da metilação de quatro CpGs da MGP. Contudo, fez-se também uma avaliação de uma CpGs na linha celular de cancro da mama T47D, fazendo inicialmente um tratamento com 5-azacitidina para desmetilar o genoma. A análise da metilação foi feita recorrendo a um tratamento com bissulfito e posterior análise por PCR. Conclusão: As duas variantes podem ser expressas em simultâneo, sendo que em todas as linhas celulares em estudo foi comprovada a expressão da variante E4, já a variante E5 não foi detetada em várias linhas celulares. Ensaio do risco mostrou que uma maior expressão da MGP (tanto variante E4 como E5, sendo que na variante E4 os resultados foram mais significativos) parece promover uma diminuição da taxa de migração celular, sendo que após as 72h de ensaio as células não transfectadas (ou transfetadas com vetor vazio) tinham já ocupado 100% da área, enquanto que as células transfetadas com E5 só foi possível verificar os 100% às 96h, e nas células transfetadas com E4 ao fim das 96h ainda não tinha ocorrido 100% de área invadida. Os ensaios in silico demostraram que a MGP está mais expressa no tecido tumoral, e que há uma correlação negativa entre expressão da MGP e metilação (ocorrendo uma hipometilação no tecido tumoral) assim como com a expressão de mir155. Sabendo que MGP inibe calcificação e, está relacionada com a angiogénese, parece que a maior expressão da MGP em tecido tumoral seja um mecanismo do tumor para promover a angiogénese – uma marca do cancro (Hallmark of Cancer)