Definição dos mecanismos de polaridade celular durante a citocinese

Dissertação de Mestrado, Oncobiologia – Mecanismos Moleculares do Cancro, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016A conclusão do processo da citocinese é o evento final da divisão celular. De forma a garantir a estabilidade genética dos organismos a citocinese não pode ocorrer antes que os cromossomas sejam fielmente segregados. Falhas neste processo são uma importante causa de instabilidade genética, ou seja, quando desregulado este processo poderá conduzir a anormalidades em organismos multicelulares, como o cancro. Durante a citocinese há a constrição do anel de actmiosina, seguindo-se a formação da ponte intercelular, na qual no meio se encontra o midbody. Este é constituído por várias proteínas que são necessárias para o início da abscisão (ex: hsMOB4A e hsMOB4B, γ-tubulina, centriolina, etc). Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram que as proteínas hsMOB4A e hsMOB4B são essenciais para a execução da abscisão e que quando depletadas aumentam a mobilidade celular. Muitas proteínas que se localizam no midbody, encontram-se também noutras estruturas (ex: centrossomas). Esta diversidade de localizações e funções, torna a dissecação do mecanismo citocinético complicado, sendo de difícil análise a função de cada proteína associada a uma localização celular, apenas através da técnica de RNAi. Uma técnica que permite a inactivação temporal e local é a Chromophore Assited Laser Inactivation (CALI). A base desta técnica é a inactivação local da proteína de interesse devido a geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS) após a iluminação com um laser. Neste trabalho, foram desenvolvidas ferramentas para a realização de ensaios de CALI. Criaram-se linhas estáveis a expressar β-tubulina-SNAP-tag e γ-tubulina-SNAP-tag para otimização dos ensaios de CALI e, também, para analisar qual a função destas proteínas na abscisão. Para ensaios de CALI em conjunto com a técnica de RNAi (para deplecção da hsMOB4A e hsMOB4B endógenas) nas proteínas hsMOB4A e hsMOB4B, foram concebidos e caracterizados clones hsMOB4A e hsMOB4B resistentes ao RNAi, com o objectivo da geração de duas linhas estáveis, SNAP-tag-hsMOB4A e SNAP-tag-hsMOB4B resistentes ao RNAi, de modo a perceber qual a localização necessária destas proteínas para que ocorra o processo de abscisão. Todas estas ferramentas desenvolvidas ao longo deste trabalho, permitirão realizar ensaios de CALI nas proteínas de interesse e compreender qual a sua localização para que ocorra o evento final da citocinese, a abscisão.The completion of cytokinesis process is the final event of cell division. In order to guarantee the genetic stability of organisms cytokinesis cannot occur before the chromosomes are properly segregated. Failures in this process are an important cause of genetic instability, that is, when dysregulated this may lead to abnormalities in multicellular organisms, such as câncer. During cytokinesis there is a constriction actmiosin ring, following the formation of the intercellular bridge, in which in the middle is the midbody. This is composed of various proteins, these proteins which are necessary for the start of the constriction (eg hsMOB4A and hsMOB4B, γ-tubulin, centriolin etc.). Previous work from our group showed that the hsMOB4A and hsMOB4B proteins are essential for the implementation of abscission and when depleted increase cell motility. Many proteins that are located in the midbody, are also found on other structures (eg centrosomes). This diversity of locations and functions turns the dissect of cytokinetic mechanism difficult, and is also difficult to analyze the function that is associated with the location of each protein trough the RNAi technique. The technique that allows temporal inactivation and locally is the Chromophore-Assisted Laser Inactivation (CALI). The basis of this technique is the local inactivation of the protein of interest due to generation of reactive oxygen species (ROS) after illumination with a laser. In this work, tools have been developed for conducting assays CALI. Stable lines were created, expressing β-tubulin-SNAP-tag and γ-tubulin-SNAP-tag for optimization of CALI tests and also to analyze what the function of these proteins in abscission. For CALI tests together with the RNAi technique (for depletion of endogenous and hsMOB4A hsMOB4B) in the hsMOB4A and the hsMOB4B proteins, the hsMOB4A and hsMOB4B RNAi-resistant clones were designed and characterized, with the aim of generating two stable lines, SNAP- hsMOB4A and SNAP-tag-tag-resistant hsMOB4B RNAi, in order to understand what is localization of this protein to occur the abscission process. All of these tools developed during this work, will allow to perform CALI tests in proteins of interest and, understand what is the location that the signal has to come to occur the final event of cytokinesis, the abscission