Locust bean gum-based microparticles for pulmonary delivery of antibiotics

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016A administração de fármacos por via pulmonar tem sido abordada com elevado interesse, conduzindo-se ao crescimento do desenvolvimento de sistemas de libertação específicos para esta via. A sua reduzida atividade enzimática, a prevenção do metabolismo hepático, a superfície elevada, o fino e permeável epitélio alveolar e a vasta rede vascular, tornam-na elegível para a administração sistémica. Mas também, por permitir a elevada deposição de fármaco em elevada concentração numa zona específica do pulmão, permitindo assim, aumentar a sua ação terapêutica, reduzindo a dose total, efeitos adversos sistémicos e efeito de primeira passagem. É largamente utilizada para a veiculação de fármacos para o tratamento local de doenças respiratórias como a asma e fibrose cística, e atualmente investigada para a veiculação de antibióticos para o tratamento de doenças infeciosas, como a pneumonia ou a tuberculose. A tuberculose apresenta ainda uma elevada prevalência e incidência a nível mundial, em 2012, estimou-se o aparecimento de 8.6 milhões de novos casos e 1.3 milhões de casos de mortalidade. Sendo que uma das principais causas de morte é a baixa adesão a terapia oral atual, e consequentemente a falha terapêutica desta. A administração de sistemas que veiculem fármacos antituberculosos tem sido vista como uma abordagem terapêutica que potencialmente será eficaz e segura. Os sistemas micropartículados produzidos, por exemplo, por atomização, tem sido bastantes explorados, devido, a se poderem modular as suas características, de modo, a que exibam características aerodinâmicas adequadas (tamanho geométrico, densidade e forma) para alcançar a região alveolar. A goma de alfarroba (LBG) é um polissacarídeo neutro, que é extraído a partir das sementes de alfarroba, e tem sido largamente utilizado, em aplicações farmacêuticas, devido, a sua baixa citotoxicidade, propriedade bioadesivas e gelificantes. Este polímero pertence a classe dos galactomanamos, e é composto por unidades de mannose e galactose, num ratio aproximadamente de 4/1. A sua estrutura molecular consiste numa ligação linear de unidades (1-4)--mannose com uma unidade de (1-6)-α-galactose. A obtenção de micropartículas com esta estrutura, e com capacidade de atingirem a região alveolar, permite proporcionar o direcionamento destes sistemas para os macrófagos alveolares, onde reside o agente infecioso, Mycobacterium tuberculosis, e permitirem que haja a libertação intracelular dos fármacos veiculados. Este direcionamento deve-se ao facto de os macrófagos alveolares infetados expressarem o receptor da mannose, que ao reconhecer estruturas com mannose, irá conduzir a sua fagocitose, de um modo, mais específico e rápido, comparativamente com sistemas que não tenham esta estrutura. Neste contexto, este trabalho propõe o desenvolvimento de sistemas microparticulados, utilizando a goma de alfarroba, para a produção de micropartículas através da técnica de atomização. Pretende-se que este polímero veicule dois fármacos antituberculosos de primeira linha, a isoniazida (INH) e a rifabutina (RFB). Os sistemas microparticulados obtidos serão caracterizados em termos de propriedades aerodinâmicas, de eficácia de encapsulação e capacidade de permitirem a libertação dos fármacos num ambiente alveolar e do fagolisossoma. A sua biocompatibilidade será analisada em duas linhas celulares representativas do epitélio alveolar (A549) e dos macrófagos alveolares (macrófagos diferenciados a partir de THP-1). A capacidade de as partículas com uma matriz de LBG em serem fagocitadas será avaliada na dose de 50 μg/cm2 em duas linhas celulares de macrófagos, macrófagos diferenciados a partir de THP-1 e em macrófagos alveolares provenientes de ratinho (NR8383). A capacidade destas micropartículas em ativarem macrófagos será também avaliada nos macrófagos diferenciados a partir de THP-1. A utilização da goma de alfarroba neste contexto nunca fora descrita anteriormente. Pelo que torna as quatro formulações desenvolvidas com diferentes ratios de fármacos, uma nova abordagem/proposta para a terapêutica de tuberculose, ou a sua potencial adaptação para outra doença infeciosa do trato inferior respiratório. Deste modo as formulações desenvolvidas foram: partículas sem fármaco: Unloaded LBG e partículas com fármaco (ratio polímero:fármaco), LBG.INH 10:1, LBG.RFB 10:0.2, 10:0.5, 10:1 e LBG.INH.RFB 10:1:0.5 e 10:1:1. Apesar de a goma de alfarroba formar dispersões viscosas, devido a não solubilizar por completo, foi necessário a adição de ácido clorídrico (HCl) 0.1 M, para que fosse possível a sua atomização. Permitindo-se assim obter com um rendimento satisfatório (entre 58 a 71%), micropartículas com tamanho adequado para a administração alveolar (entre 1.26 a 1.50 μm). Para além do tamanho adequado, apresentam também valores de densidade real (aproximadamente 1.45 g/cm3) e de diâmetro aerodinâmico (entre 1.27 a 1.90 μm), que indicam a sua capacidade de atingirem a zona alveolar. Apesar de a INH ser um fármaco hidrofílico e a RFB ser um fármaco hidrofóbico, foi possível a sua encapsulação na matriz hidrofílica da LBG, com valores elevados de eficácia de encapsulação (> 82%). Outra justificação para a adição de HCl na formulação, foi a necessidade, de na molécula de RFB, haver um processo de desprotonação, que permitisse a sua solubilização em meio aquoso. O perfil de libertação de INH e RFB foi analisado a partir da formulação LBG.INH.RFB 10:1:0.5, verificando-se a libertação de ambos os fármacos num perfil semelhante em meio com pH 7.4, representativo da região alveolar. O perfil de libertação de INH a partir da formulação de LBG.INH foi avaliado, em dois meios, o representativo da região alveolar, e um representativo do fagolissosoma dos macrófagos, pH 5, estrutura formada após a fagocitose da micropartícula, e onde se irá libertar o fármaco. Em ambos os meios se obteve um perfil de libertação rápido de INH. A biocompatibilidade dos fármacos, matéria-prima e sistemas micropartículados produzidos foi avaliada em duas linhas celulares, uma representativa do epitélio alveolar (A549) e outra representativa dos macrófagos alveolares (macrófagos diferenciados a partir de células THP-1). E é feita através da avaliação da atividade metabólica (MTT) e da libertação da enzima lactato desidrogenase (LDH). Os resultados obtidos nos dois testes foram concordantes entre si, e verificou-se que nas concentrações testadas o fármaco RFB é citotóxico, com um índice de concentração que inibe a proliferação/população celular em 50 % (IC50), nestas duas linhas celulares, idêntico aos ratios testados. Apenas formulações que contêm RFB, se observa uma redução da viabilidade celular para estas duas linhas celulares, abaixo, do limite aceitável para formulações farmacêuticas (70%). No polímero observa-se alguma citotoxicidade nas células A549, que não está presente nas Unloaded LBG. Diversas razões foram apresentadas para a explicação desta citotoxicidade da RFB, sendo que por comparação com as Unloaded LBG MPs, se justifica, que a presença de HCl necessário na formulação, em associação com a RFB faz com que exista um efeito sinérgico na redução da viabilidade celular. É proposto a redução do ratio de RFB para um inferior aos desenvolvidos, usar HCl 0.01M para a sua encapsulação, e testar um novo excipiente para a redução da viscosidade da LBG. A biocompatibilidade foi também avaliada, quando os sistemas micropartículados são apresentados em aerossol. As micropartículas selecionadas foram as seguintes: Unloaded LBG, LBG.INH 10:1, LBG.RFB 10:0.5 e LBG.INH.RFB 10:1:0.5 na dose 303 μg/cm2, correspondente à concentração mais elevada em que amostras foram testadas quando apresentadas em solução. As micropartículas foram insufladas sobre uma monocamada de macrófagos alveolares. Como em todas se apresentou uma elevada redução de citotoxicidade, selecionou-se as Unloaded LBG e LBG.INH.RFB 10:1:0.5 e testou-se na dose 50 μg/cm2, verificando-se um aumento da viabilidade celular, em ambas, mas maior nas partículas brancas. Reforçando também, que as doses testadas são elevadas, comparativamente com a dose fármaco/sistema administrada in vivo, onde se esperam melhores resultados de viabilidade celular. Através de citometria de fluxo, foi analisado a capacidade de os macrófagos fagocitarem micropartículas com a matriz de LBG nas linhas celulares referidas. Onde se verificou a existência de uma elevada percentagem de fagocitose nos macrófagos diferenciados a partir de THP-1 (99,5 %), e nas NR8383, uma preferência significativa por micropartículas de LBG (94,35 %) comparativamente com um polímero sem mannose na sua estrutura (53,16%). Após comprovada a capacidade dos macrófagos em fagocitarem micropartículas de LBG, foi avaliada a capacidade deste galactomanano em ativar macrófagos, diferenciados a partir de THP-1, e que se encontram no estado M0 de ativação, para o estado M1, com capacidade pro-inflamatória. Após a exposição destas células, á uma solução da matriz de LBG e de micropartículas de LBG.INH.RFB 10:1:0.5 na dose de 303 μg/cm2, verificou-se que, devido a sua estrutura, a LBG tem a capacidade de induzir a libertação de citocinas, factor de necrose tumoral α e interleucina 8, num nível idêntico ao lipopolissacarídeo, presente na parede bacteriana, e com num nível superior e estatisticamente significativo comparativamente com o nível basal. Estes resultados reforçam que as micropartículas obtidas a partir deste polímero, através de atomização, apresentam propriedades aerodinâmicas que permitem que atinjam a região alveolar, e sejam veículos de fármacos antituberculosos ou de um outro antibiótico. E devido a sua estrutura com mannose, permitem que haja um reconhecimento específico pelos macrófagos alveolares infetados, permitindo potenciar a sua fagocitose. Após este processo, estas micropartículas permitem a libertação dos fármacos em meio intracelular, e ainda, activarem os macrófagos, para um estado de ativação pro-inflamatório, que irá melhorar a resposta inflamatória, e consequentemente, um melhor controlo o agente infecioso