Estudo da biodiversidade molecular de Quercus suber e caracterização de genes envolvidos na resposta de defesa à infecção por Phytophthora cinnamomi

O sobreiro (Quercus suber L.) é uma espécie autóctone que se encontra distribuída em todo o território de Portugal Continental. São excepção as regiões montanhosas mais frias do norte e centro, as regiões salinas junto ao litoral e as zonas do interior de acentuada aridez. Os indivíduos desta espécie apresentam características morfológicas muito variadas com ocorrência de diversas gradações entre caracteres do mesmo órgão e diferentes graus de tolerância, aparente, à doença do declínio. A semelhança genómica descrita dentro do género Quercus determina a ausência de barreiras reprodutivas e possibilita fenómenos de hibridação nos povoamentos mistos de Q. suber e Q. rotundifolia. O recurso à análise do DNA para determinação do perfil genético dos indivíduos de uma espécie, consiste no método mais recente de individualização biológica. No presente estudo, foi avaliada a variabilidade genética em Q. suber por AFLP (amplified fragment length polymorphism), com cinco combinações de primers diferentes, que permitiram diferenciar 313 árvores provenientes do Algarve, Alentejo e Trás-os-Montes, de acordo com o seu genótipo. O perfil genético de cada sobreiro resultou da análise de 291 loci aleatórios do genoma, presentes na forma de fragmentos monomórficos e polimórficos. A avaliação quantitativa das semelhanças ou dissemelhanças entre os indivíduos foi determinada pelo método de análise de dados/taxonomia numérica. A percentagem de polimorfismo detectada nos sobreiros é de 71 % e é indicadora de índices elevados de variabilidade na espécie. A diversidade genética é semelhante nas populações estudadas do Algarve, Alentejo e Trás-os-Montes. A elevada variação fenotípica que se observa em Q. suber ao nível da qualidade da cortiça produzida e da aparente tolerância à doença do declínio é reflectida nos padrões AFLP. Os valores dos coeficientes de semelhança genética variam entre 0,88 e 0,61, o que significa que, apesar da elevada diversidade genética, os sobreiros partilham entre si 60 % do genoma. No grupo dos 313 indivíduos de Q. suber observa-se uma tendência para a separação em dois subgrupos. Na análise por AFLP com uma das combinações de primers, a combinação I9, foram incluídas 52 azinheiras provenientes das mesmas três regiões, Algarve, Alentejo e Trás-os-Montes, dos sobreiros. Duas destas azinheiras foram estudadas, também, com as outras quatro combinações de primers referidas para os sobreiros. Em todas as combinações de primers houve diferenciação entre os 313 indivíduos da espécie Q. suber e os dois indivíduos da espécie Q. rotundifolia, em concordância com a classificação sistemática destes Quercus. Na análise em que se incluíram as 52 azinheiras e os 313 sobreiros, identificaram-se indivíduos pertencentes a uma terceira espécie. Através da determinação de perfis genéticos de indivíduos de espécies diferentes do género Quercus é possível determinar as relações filogenéticas existentes entre eles. Um dos 291 marcadores AFLP está presente em quase todas as azinheiras e em onze sobreiros e este facto revela que pode ter sido adquirido por hibridação entre as duas espécies de Quercus. A metodologia usada permitiu identificar marcadores moleculares potencialmente correlacionados com fenótipos de tolerância à doença do declínio e à qualidade da cortiça. Alguns marcadores só estão presentes em sobreiros de determinada região e podem ser o resultado dum processo de adaptação ao meio. Em Portugal e Espanha a doença do declínio afecta, de um modo geral, os povoamentos de sobreiro e azinheira, atinge indivíduos de todas as idades e manifestase na forma de declínio lento ou morte súbita. O fungo do solo, Phytophthora cinnamomi, aparece invariavelmente associado aos locais de declínio e tem sido isolado, com frequência, a partir de raízes de sobreiros e azinheiras. Q. suber e Q. rotundifolia são, portanto, hospedeiros de P. cinnamomi e o fungo é capaz de colonizar os tecidos, sendo desconhecidos os mecanismos moleculares da interacção entre o hospedeiro e o agente patogénico. Através da análise do RNA mensageiro, por cDNA-AFLP, de raízes de Q. suber e Q. rotundifolia infectadas com P. cinnamomi, de folhas de plântulas de sobreiros cultivados em solos artificialmente infestados e de folhas de sobreiros localizados em locais de declínio, naturalmente infestados com o fungo, foram identificados fragmentos de genes que se expressam de forma diferencial durante a interacção. As sequências de quatro destes fragmentos apresentam homologia com genes relacionados com o sistema de defesa noutras espécies de plantas. As sequências nucleotídicas foram determinadas a partir dos cDNAs correspondentes obtidos por RACE-PCR ou, alternativamente, a partir dos genes isolados num banco genómico de Q. suber em Lambda FIX II escrutinado com sondas específicas. Foram identificados e caracterizados em Q. suber, os genes QsCAD1, QsRPc, QsPDI e QsRSH que codificam uma cinamil álcool desidrogenase 1, uma proteína de resistência a P. cinnamomi, uma isomerase de pontes dissulfureto proteica e uma proteína do tipo RelA/SpoT, respectivamente. Pelo menos três destes genes estão potencialmente envolvidos na resposta à infecção por P. cinnamomi; com efeito a expressão de QsCAD1, QsRPc e QsPDI aumenta durante as primeiras 24 horas de interacção. É conhecido que o sistema de defesa nas plantas é multifacetado e que a transcrição dos genes do metabolismo de fenilpropanóides é activada durante a interacção com agentes patogénicos. A partir de fragmentos obtidos por PCR com primers de sequência heterogénea definidos a partir de sequências conhecidas de genes do metabolismo de fenilpropanóides doutras espécies de plantas, foram determinadas sequências nucleotídicas parciais codificando uma peroxidase (QsPOX), uma cinamil álcool desidrogenase 2 (QsCAD2) e uma fenilalanina amónia liase (QsPAL) em Q. suber. Com base nesta informação foram clonados, sequenciados e caracterizados, parcial ou completamente, o cDNA e/ou DNA dos genes QsPOX (1 e 2), QsCAD2 e QsPAL que codificam duas peroxidases catiónicas, uma cinamil álcool desidrogenase e uma fenilalanina amónia liase, respectivamente. A expressão destes genes foi analisada por RT-PCR e hibridação com sondas específicas marcadas com digoxigenina, a partir de RNA total extraído de raízes de Q. suber que estiveram em contacto com o fungo durante 24 horas, verificando-se que QsPOX2 e provavelmente, QsPOX1, estão envolvidas na resposta de defesa. Relativamente aos genes QsCAD2 e QsPAL os resultados não foram conclusivos. Tendo em consideração a homologia entre as sequências de aminoácidos deduzidas dos genes identificados em Q. suber com a de proteínas já caracterizadas noutras espécies, foi possível conceber um modelo hipotético que ilustra os acontecimentos iniciais da interacção entre o fungo e o hospedeiro. Deste modo, considera-se que a infecção de Q. suber por P. cinnamomi apresenta contornos de interacção compatível e incompatível. O fungo induz a expressão de genes potencialmente implicados na desactivação de factores de virulência (toxinas) e de genes de defesa implicados no reconhecimento de factores de avirulência. A variante da doença do declínio denominada “morte súbita” estaria associada à produção duma isoforma do produto do gene QsCAD1, incapaz de converter o factor de virulência (toxina) produzido pelo fungo, num produto não tóxico para a célula. Num sobreiro que sofreu morte súbita foi identificado um fragmento polimórfico deste gene que apoia esta hipótese. O declínio lento resultaria da resistência parcial ao fungo, relacionada com a rapidez de reconhecimento dos factores de avirulência.Universidade do Algarve, Faculdade de Engenharia de Recursos Naturai