Estudo preliminar do efeito supressor de genes do Citrus tristeza virus (CTV) no silenciamento pós-transcripcional em Nicotiana benthamiana

Dissertação de mest., Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2011Uma das funções do mecanismo de silenciamento mediado por RNA presente nas células vegetais é a protecção da célula contra vírus. Neste mecanismo, o RNA de cadeia dupla (dsRNA) gerado durante o processo replicativo do vírus, é clivado por enzimas Dicer com a formação de siRNAs de 21 a 24 nucleótidos, designados “small interfering RNAs” (siRNAs). Os siRNAs formados promovem a posteriori a degradação de RNAs complementares. Os vírus codificam para proteínas supressoras que interferem neste mecanismo de silenciamento pós-transcricional. No Citrus tristeza virus (CTV), a proteína p20 foi previamente identificada como uma proteína supressora que interfere no silenciamento local e sistémico. No presente trabalho foi estudada a capacidade supressora da proteína p20 de sete isolados filogeneticamente distintos do CTV no silenciamento pós-transcricional em plantas de Nicotiana benthamiana 16C. A linha transgénica 16C de N. benthamiana que expressa a GFP foi usada para analisar a formação de siRNAs após infiltração das folhas com a estirpe de Agrobacterium tumefaciens C1C58 e a expressão transiente da GFP ou co-expressão com a p20. A análise da expressão da GFP sob luz UV revelou haver diferenças na actividade da proteína supressora p20, que foi avaliada pelo tempo decorrido até ao despoletar do silenciamento local. O silenciamento local ocorreu nas folhas inoculadas com os supressores das variantes genómicas 8.5 (severe stem pitting) e 124.7 (quick decline) ao 5º dia pós-infiltração (dpi). No entanto, o supressor da variante genómica 199.7 (mild stem pitting) manteve a expressão da GFP até ao 9º dia pós-infiltração. A análise Northern blot efectuada ao 5º dpi não se obteve resultados conclusivos, pois as bandas obtidas não apresentam diferenças significativas de intensidade para os vários supressores testados. No entanto, ficou revelado que os supressores do silenciamento p20 eliminam na quase totalidade os siRNAs de 24 nt e provocam uma forte atenuação dos siRNAs de 21-22 nt, os quais se formam nas células em resultado da expressão transiente da GFP. As análises de fluorímetria, do real time RT-PCR (qPCR), e do Western blot não apresentaram resultados conclusivos