Membrangebundenes IL-17A und IL-17F zur Herstellung spezifischer monoklonaler Antikörper für die intrazytoplasmatische Zytokinfärbung

Die Charakterisierung der Zytokine beim Haushuhn ist Schwerpunkt vieler Forschungsarbeiten. Insbesondere die IL-17 Zytokine stehen, aufgrund ihrer immunregulatorischen Funktionen im Säuger, im Fokus der Forschung. Fünf homologe IL-17 Zytokine wurden im Genom des Haushuhnes identifiziert. Ihre Regulation und Funktion ist jedoch weitgehend unerforscht. Die Phänotypisierung zytokinspezifischer Zellen im Haushuhn ist nur eingeschränkt möglich und setzt die Generierung spezifischer mAK voraus. Die Herstellung zytokinspezifischer mAK basiert auf der Immunisierung von löslichem Protein. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer neuen Methode, welche die Notwendigkeit großer Mengen an aufgereinigtem Zytokin umgeht. Dafür wurden Hühnerzytokine über einen GPI-Anker auf der Oberfläche von eukaryotischen Zellen fixiert. Es wurden zwei stabile Zelllinien generiert, welche gg IL-17A beziehungsweise gg IL 17F über einen GPI-Anker auf ihrer Oberfläche hoch exprimieren. Die transfizierten Zelllinien wurden für die Immunisierung und das Screening der Hybridome in der Durchflusszytometrie genutzt. Auf Basis des Färbeverhaltens der Hybridome auf transfizierten Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen wurden zwei gg IL-17A-spezifische mAK (9F11, 10D5) und ein gg IL-17F-spezifischer mAK (1E7) selektiert. Die Spezifität der mAK wurde aufgrund ihrer Hemmung durch rekombinante gg IL-17-Proteine bewiesen. Western Blot Analysen der rekombinanten Zytokine weisen auf eine dimere Proteinstruktur hin. Ein proinflammatorischer Effekt von gg IL-17A und gg IL-17F auf die Makrophagenzelllinie HD11 ist zudem nachweisbar. Beide Zytokine induzieren die Expression von IL-6 sowie die Freisetzung von Stickstoffmonoxid. Die generierten mAK färben natives gg IL-17A und gg IL-17F intrazellulär in transfizierten eukaryotischen Zelllinien sowie in primären Hühnerzellen. In der Milz ist eine Population gg IL-17A- sowie gg IL-17F- produzierender CD4+ Lymphozyten darstellbar, wobei es sich wahrscheinlich um Th17-Zellen handelt. Zusammenfassend stellt das Verfahren, Zytokine über einen GPI-Anker auf eukaryotischen Zellen zu exprimieren, eine erfolgreiche Methode dar, spezifische mAK zu produzieren. Die generierten mAK 1E7, 9F11 und 10D5 repräsentieren, durch ihre Fähigkeit Zytokine intrazytoplasmatisch detektieren zu können, ein wichtiges Instrument, die Expression sowie die biologische Funktion von gg IL 17A und gg IL-17F im Haushuhn weiter zu charakterisieren und die IL-17- produzierenden Zellen auf Einzelzellebene zu untersuchen.The characterization of chicken cytokines is in the focus of many studies. Because of their immunoregulatory properties in mammals, the IL-17 cytokines are of high interest. Five homologous IL-17 cytokines have been identified in the chicken genome, but their regulation and functions are mostly unknown. The phenotypic characterization of cytokine specific cells in the chicken is restricted and depends on the availability of specific monoclonal antibodies (mab). The generation of specific mab is based on the immunization with soluble proteins. The aim of this study was to establish a new method bypassing the need for a high amount of purified cytokines. For this purpose, chicken cytokines were attached to eukaryotic cells via a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. Two stable cell lines were generated expressing GPI gg IL-17A and GPI IL-17F respectively. The transfected cell lines were used for immunization and screening of the hybridomas by flow cytometry. According to their staining profile on transfected cells versus non-transfected cells two gg IL-17A specific mab (9F11, 10D5) and one gg IL-17F (1E7) specific mab were selected. The mab specificity was verified by inhibition with the appropriate recombinant cytokine. The recombinant proteins showed dimerization in Western Blot. In addition, a proinflammatory effect of gg IL-17A and gg IL-17F on the chicken macrophage cell line HD11 was demonstrated. Both cytokines induce the expression of IL-6 as well as the release of nitric oxide by HD11 cells. The mab detect intracytoplasmatic gg IL-17A and gg IL-17F in transfected cell lines as well as in primary chicken cells. In the spleen a population of gg IL-17A and gg IL-17F producing CD4+ lymphocytes is detectable, probably representing Th17 cells. In summary the expression of GPI linked cytokines on eukaryotic cells is a good alternative to generate specific monoclonal antibodies. The generated mab 1E7, 9F11 and 10D5 are applicable for intracellular staining. They represent an important tool to further characterize the expression and biological function of gg IL-17A and gg IL-17F as well as to investigate IL-17 producing cells at the single cell level in the chicken