Das Phagenschock-Protein LiaH aus Bacillus subtilis

Für das Überleben von Bacillus subtilis ist eine verlässliche Überwachung der Integrität der Zellhülle essentiell, um diese zu schützen und bei Schäden adäquat zu reagieren. Neben den ECF � Faktoren spielen Zwei-Komponenten-Systeme (2KS) in der Zellhüllstressantwort von B. subtilis eine zentrale Rolle. Eines dieser Systeme, das LiaRS- 2KS reagiert auf eine große Anzahl verschiedener Zellwand-Antibiotika sowie andere zellhüllstress-auslösende Substanzen. Die zelluläre Funktion und Rolle des Lia-Systems konnte bisher nicht genau definiert werden. In der hier vorliegenden Dissertation wurde das Lia-System erstmals hinsichtlich seiner funktionalen Rolle in B. subtilis untersucht. Im ersten Teil der Ergebnisse wurde eine detaillierte Analyse der LiaR-vermittelten Zellhüllstressantwort in B. subtilisvorgenommen. Transkriptom-Studien dienten zur Identifizierung des LiaR-Regulons. Hierbei wurde die Genexpression des Wildtyps mit zwei Mutanten, die den „ON“ (�liaF) und „OFF“ (�liaR) Zustand des Lia-Systems repräsentierten, verglichen. Von den dabei identifizierten drei potentiellen LiaR-Zielloci (liaIH, yhcYZ-ydhA, ydhE) konnten durch anschließende Folgeuntersuchungen nur die Gene liaI und liaH als in vivo relevante Zielgene für LiaR verifiziert werden. Umfangreiche phänotypische Analysen zeigten, dass �liaIH-Mutanten nur schwach sensitiv auf einige Antibiotika sowie oxidativen Stress reagierten. Ebenso vermittelt eine Überexpression von LiaH in einer �liaF-Mutante keine Resistenz gegenüber stressauslösenden Substanzen. LiaH gehört zur Familie der Phagenschock-Proteine. Weitere Mitglieder dieser Familie sind PspA aus Escherichia coli und Vipp1 aus Arabidopsis thaliana, die große oligomere Ringstrukturen bilden. Die strukturelle Untersuchung von LiaH ergab, dass auch dieses Protein große Ringe bildet (>1MDa). Der zweite Ergebnisteil befasst sich mit der Untersuchung der Stimuluswahrnehmung der Zellhüllstress-detektierenden Systeme in B. subtilis. Die Zellhüllstressantwort auf das Antibiotikum Bacitracin wurde hierbei mittels �-Galaktosidase-Assay sowie Western Blot- Analyse erforscht. Das Bce-System reagiert dabei am stärksten und spezifischsten auf Bacitracin-Stress. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass der ABC-Transporter BceAB essentiell für die Stimuluswahrnehmung ist und dass das Bce-System an sich eine Resistenzdeterminante in B. subtilis darstellt. Das Lia-System hingegen wird erst bei höheren Bacitracin-Konzentrationen induziert. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das Bce-System Bacitracin direkt wahrnimmt (drug sensing) und das LiaSystem in indirekter Weise auf Zellhüllstress ausgelöst durch Bacitracin reagiert (damage sensing). Im dritten Teil der Ergebnisse wurdendie zelluläre Lokalisation von LiaI, LiaH und LiaG sowie die Beziehung der Proteine untereinander mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und biochemische Ansätze untersucht. Die Membranproteine LiaI und LiaG sind unter Stressbedingungen in der Zellmembran lokalisiert. LiaH, ein cytoplasmatisches Protein verändert unter Stressbedingungen seine Lokalisation vom Cytoplasma an die Membran. Die Funktion von LiaH scheint sich also an der Zellmembran zu vollziehen, wobei LiaI als Interaktionspartner identifiziert wurde. Da in einer �liaI-Mutante LiaH unter Stressbedingungenebenfallsnoch an die Zellmembran assoziert ist, wurde nach weiteren Interaktionspartnern von LiaH gesucht. Eine umfangreiche bacterial-two-hybrid-Analyse ergab, dass sowohl LiaH als auch LiaI und LiaG in ein Interaktionsnetzwerk eingebettet sind, in welchem das bisher uncharakterisierte Protein YvlB eine Schlüsselrolle spielt.Die ebenso in dieses Netzwerk involvierten Proteine YjoB, DnaK und HtpG üben als Proteasen/Chaperone Funktionen in der Faltung und Degradierung von Proteinen aus. Ein Zusammenspiel des Lia-Systems und des Schlüsselproteins YvlB mit den Proteasen/Chaperonen als Reaktion auf Zellhüllstress ist denkbar. Die Phagenschock-Homologe PspA in Streptomyces lividans und E. coli üben einen erheblichen Einfluss auf die Proteinsekretion sowie die elektronenmotorische Kraft der Zelle aus. Daher wurde im letzten Teil der Ergebnisse die Rolle von LiaH in der Proteinsekretion sowie im Energiestoffwechsel näher analysiert. Ein Einfluß des Lia- Systems in der Aufrechterhaltung der elektronenmotorischen Kraft der Zelle konnte nicht bestätigt werden. Durch die Analyse des Sekretoms in B. subtilis konnte gezeigt werden, dass das extrazelluläre Proteom einer �PliaI-liaIH-Mutante im Vergleich zum Wildtyp signifikante Veränderungen in der Komposition aufwies.So wurde im Sekretom der �PliaIliaIH- Mutante vor allem das Zellwand-assoziierte Protein WapAidentifiziert, welches im Wildtyp oder in einer �liaF-Mutante nicht auftrat. Das Lia-System beeinflußt somit auch die Proteinsekretion von B. subtilis, wobei die molekularen Mechanismen noch unbekannt sind.Monitoring the integrity of the cell envelope is crucial for the survival of Bacillus subtilis. Two-component-systems (2KS) form an integral part of the cell envelope stress response in this organism. One such system, the LiaRS-2KS responds to a number of diverse cell wall antibiotics as well as other envelope perturbating agents. But the exact cellular role of the Lia-System remains elusive. In the context of this thesis the Lia-System was functionally investigated for the first time. In the first part of the results, a detailed microarray-based analysis of the LiaR-dependent cell envelope stress response was performed to identify the LiaR regulon. The gene expression profile of the wild type and two mutants, representing the “ON” (�liaF) and “OFF” (�liaR) status of the Lia-system, were compared. Three potential target transcripts, liaIH, yhcYZ-yhdA, ydhE, were identified. By follow-up analysis we could only verify the genes liaI and liaH as in vivo relevant targets of LiaR-dependet gene regulation. In depth phenotypic profiling revealed weak sensitivities of a �liaIH mutant in the presence of some antibiotics and compounds causing oxidative stress. But overexpression of LiaH in a �liaF mutant did not confer resistance against these substances. LiaH belongs to the phage shock protein family. Other members of this family, such as PspA of Escherichia coli and Vipp1 of Arabidopsis thaliana, form large oligomeric ring structures. A structural investigation of LiaH also revealed the formation of large rings (>1 MDa) with a nine-fold rotational symmetry, emphasizing the similarities between these proteins. In the second part of the results, the mechanism of stimulus perception of cell envelope stress responding systems in B. subtilis was investigated by using �-galactosidase assays and western blot analysis. It was found that the Bce-system responds in a highly specific way to bacitracin stress. In B. subtilis the Bce-system confers resistance against bacitracin. Similarly, the BceAB transporter is also essential in stimulus perception. In contrast, the Lia-system is responding to higher concentrations of bacitracin, only. In summary, this led us to conclude that the Bce-system is a direct drug sensing system whereas the Lia-system is an indirect damage sensing system of the stimulus perception under cell envelope stress conditions. In the thirth result section, the cellular localisation and relationship of the proteins LiaI, LiaH and LiaG were determined by using fluorescence microscopy and biochemical methods. Under stress conditions, the membrane proteins LiaI and LiaG are localized at the cell membrane of B. subtilis. In contrast, the localization of LiaH, a cytoplasmic protein, is highly dynamic. Under bacitracin stress, LiaH is relocated from the cytoplasm to the membrane, its proposed site of action, where LiaI acts as its membrane anchor. Since LiaH was also observed at the membrane in a �liaI mutant, we searched for additional interaction partners of LiaH. By performing a comprehensive bacterial-two-hybrid analysis, we could demonstrate that LiaH, LiaI and LiaG are parts of a complex proteinprotein- interaction network, in which the so far uncharacterized cytoplasmic protein YvlB seems to play a central role. Other proteins that are involved in this network are YjoB, DnaK and HtpG. These proteins act as proteases/chaperones in the folding as well as the degradation of proteins. The phage shock proteins PspA in Streptomyces lividans and E. coli notably affect both the protein secretion and the proton motive force. Therefore, the influence of LiaH in protein secretion and proton motive force in B. subtilis cells was analysed in the last part of the results.We could not observe any influence of LiaH in maintaining the proton motive force of the membrane.By mapping of the secretome, a significant change in composition of extracellular proteins in a �PliaI-liaIH mutant was demonstrated. The extracellular proteome of a �PliaI-liaIH contains a significant increased amount of the cell wallassociated protein WapA, which was absent in the wild type or in the �liaF mutant. Hence, protein secretion is also affected by the phage shock protein LiaH in B. subtilis, but the molecular mechanism of this influence is yet unknown