Fluoreszenz in situ Hybridiseirung zum Nachweis bakterieller Erreger bei Mukoviszidose

Die Mukoviszidose (engl: cystic fibrosis, CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv vererbte Stoffwechselerkrankung der kaukasischen Bevölkerung. Der Defekt des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, einem membranständigen Chloridionenkanal, manifestiert sich an diversen Organsystemen, wobei Infektionen des Respirationstraktes im Vordergrund stehen. CF-Patienten produzieren ein viskoses Tracheobronchialsekret, welches die mukoziliäre Clearance behindert. In der Folge etablieren sich chronisch verlaufende Lungeninfektionen mit einem CF-typischen Erregerspektrum (v.a. Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia-Komplex, Haemophilus influenzae und Stenotrophomonas maltophilia), die letztendlich lebenslimitierend sind. Durch die frühzeitige und regelmäßige Gabe von Antibiotika wird versucht, die inflammatorische und erregerassoziierte Schädigung des Lungengewebes zu kontrollieren. Dabei ist eine mikrobiologische Diagnostik, die die Erreger schnell und mit hoher Sensitivität und Spezifität identifiziert, von großer Bedeutung. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) mit markierten Oliginukleotidsonden zum Nachweis ribosomaler RNS ist eine spezifische und sensitive Methode zum Erregernachweis. Sie benötigt im Vergleich zum mindestens 48h in Anspruch nehmenden kulturellen Nachweis nur wenige Stunden und erfasst auch bereits nicht mehr kultivierbare Erreger, z.B. nach erfolgter Antibiotikatherapie. Das relativ begrenzte Erregerspektrum der Lungeninfektionen bei CF bietet gute Voraussetzungen für den Einsatz der FISH-Diagnostik. Als problematisch hat sich hierbei das viskose und inhomogene CF-Sputum erwiesen, das aufgrund seiner Zusammensetzung bei der Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Sonden eine ausgeprägte Hintergrundfluoreszenz zeigt. Ziel dieser Arbeit war es, den Einsatz der FISH-Technik zum Nachweis CF relevanter Erreger weiter zu optimieren. Zum einen sollte der Einfluss, den die Probenlagerung bis zur Weiterverarbeitung auf den Erregernachweis hat, untersucht werden. Dabei erwies sich 4ºC als geeignete Lagerungstemperatur, da die Mikroorganismen trotz Verringerung der Ribosomenzahl und damit etwas abgeschwächtem Fluoreszenzsignal bis zu 72h nach Probenentnahme mit FISH unverändert sensitiv nachweisbar sind, ohne dass eine Überwucherung langsamer wachsender Keime eintritt. Zum anderen sollte eine Minimierung der Hintergrundfluoreszenz erreicht werden. Verschiedene Modifikationen des Hybridisierungsprotokolls wurden miteinander verglichen. Durch die Absättigung unspezifischer Bindungsstellen der Oligonukleotidsonden mittels einer 30minütigen Vorinkubation mit freiem Biotin wurde die Hintergrundfluoreszenz erfolgreich vermindert, wobei die markierten Bakterien unverändert gut nachweisbar waren. Um die quantitative Auswertung der Sputumproben zu vereinfachen, wurde weiter ein Protokoll zur Analyse der FISH-Proben im Durchflusszytometer entwickelt. Durch diese schnelle, automatisierte Technik entfällt die zeitraubende manuelle Auswertung der Proben. Eine Integration dieser neu entwickelten Ergänzungen in bestehende Protokolle vereinfacht und beschleunigt die mikrobielle Diagnostik CF-typischer Erreger und eröffnet die Möglichkeit eines größeren Probendurchsatzes ohne zusätzliche Kosten